生物药物合成集落刺激因子

生物药物合成集落刺激因子第1页/共26页细胞因子的概念机体的免疫细胞和非免疫细胞能合成和分泌小分子的多肽类因子，它们能调节多种细胞生理功能，称为细胞因子（Cytokines）。细胞因子包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子等。前言第2页/共26页白细胞介素（Interleukin,IL）

肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）干扰素（Interferon,IFN）集落刺激因子（Colonystimulatingfactor,CSF）生长因子（Growthfactor,GF）趋化因子（Chemokine）细胞因子分类按功能分：第3页/共26页前言药物介绍发酵生产工艺简介总结第4页/共26页药物介绍粒细胞集落刺激因子（granulocy-colonystimulatingfactor,G-CSF)粒细胞集落刺激因子（granulocy-colonystimulatingfactor,G-CSF)：是一种促进中性粒细胞生长的细胞因子。G-CSF的作用：主要是支持粒系造血肝细胞的生存，促进这些细胞分化为成熟的中性粒细胞，促进骨髓施放中性粒细胞，提高中性粒细胞吞噬抗原、形成氧自由基的能力，从而消灭细菌。本质：一种糖蛋白,含有174个氨基酸，分子量约为19.6KD，

PI=6.0，分子中有5个半胱氨酸残疾，形成2个二硫键来源：主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞。第5页/共26页药物介绍基因编码的蛋白质基因定位在染色体17,它的基因含有5个外

显子和4个内含子,现已成功地分离出两个

cDNA,分别编码177个和174个氨基酸的

蛋白质。分析表明两种形式的G一CSF都

有生物活性,但作用上可能有所差别。第6页/共26页药物介绍适应症1.促进骨髓移植后中性粒细胞计数增加。2.癌症化疗引起的中性粒细胞减少症。包括恶性淋巴瘤、小细胞肺癌、胚胎细胞瘤（睾丸肿瘤、卵巢肿瘤等）、神经母细胞瘤等。3.骨髓异常增生综合症伴发的中性粒细胞减少症。4.再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。5.先天性、特发性中性粒细胞减少症。第7页/共26页国外研究进展

1991年2月，安进公司的产品--重组粒细胞集落刺激因子Neupogen（G-CSF）获得美国FDA批准，其适应症为自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、AIDS等。

Neulasta为安进公司开发的Neupogen的长效剂型，即通过对粒细胞集落刺激因子进行聚乙二醇（PEG）修饰，延长其在体内的代谢时间，因此疗效更好。

Neulasta在2002年获得FDA的上市批准，并于2002年第二季度上市。Neulasta一上市就十分抢眼，2003年全年的销售额为13亿美元，其霸气直逼EPO。美国第8页/共26页

1994年，日本中外制药株式会社研制成功并上市rhG－CSF,其后是日本麒麟公司的rhG－CSF（商品名：中文商品名：惠尔血），紧接着日本麒麟啤酒公司的rhG－CSF进入中国市场，年销售额约为10亿日元，

1995年又与中国药厂合作，在中国分装G－CSF。分泌型重组人粒细胞集落刺激因子虽有一家国内公司已经投放市场，但因其工艺水平落后，没有形成产业规模。2008年分泌型重组人粒细胞集落刺激因子有一家日本公司已经形成产业规模。日本国外研究进展第9页/共26页国内进展国内主要生产企业包括杭州九源和长春高新、厦门特宝等，目前已有近20家企业的产品进入市场，销售战场已起硝烟。现我国有20多家企业生产重组粒细胞集落刺激因子，但规模都不大，竞争十分激烈。第10页/共26页第二节生产工艺第11页/共26页生产工艺工艺流程目的基因的发现模版DNA的制备PCR技术制备工程菌工程菌高密度培养第12页/共26页目的基因的发现第13页/共26页PCR扩增聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增得到大量目的基因，之后导入到大肠杆菌中，制备成工程菌----发酵生产的种子。第14页/共26页工程菌发酵----高密度培养高密度培养现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。例如，人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。第15页/共26页高密度培养方法（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。（4）防止有害代谢产物的生成。第16页/共26页rhG-CSF发酵生产的研究概况1986年Nagata和Souza各自克隆了人G-CSFcDNA，并在哺乳动物和原核细胞中进行表达。1993年瞿成奎等人在国内首先克隆了人G-CSFcDNA，并在大肠杆菌中获得表达。由于原核细胞表达系统缺乏糖基化等翻译后的加工能力,生产的G-CSF在体内会部分讲解而降低药效，所以研究人员在真核细胞表达系统中进行了G-CSF基因的构建，如在酵母、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、T抗原猴细胞系（COS7）等表达系统中均成功实现了G-CSF的表达。为了使G-CSF的产量有进一步的提高,研究人员还进行了将G-CSF与其它细胞因子融合表达的研究,如崔立斌等人成功的获得了G-CsF-硫氧还原蛋白融合蛋白的可溶性表达,表达水平为总细胞可溶蛋白的41%。同时在rhG-CSF发酵生产方面也进行了很多研究,如方向东等人构建的表达载体pJGW1转化E.Coli.使rhG-CSF表达量占总蛋白的30%。刘社际等研究了培养温度对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响，在发酵时采用不同的培养温度进行培养,连续三批发酵,细胞密度(0D600)达到25.0,菌体干重23g/L,rhG-CSF表达量为26.9%。胡志明等筛选了大肠杆菌表达rhG-CSF的发酵工艺,在20L发酵罐中进行培养,菌体湿重为15.6g/L，rhG-CSF表达量达到30%。第17页/共26页发酵工艺举例一.工程菌的获得用带有rhG-CSFa基因的pQE3表达载体转化E.coliM15菌株。筛选能够稳定地表达rhG-CSFa的重组菌株作为工程菌株，冻存于液氮中。第18页/共26页发酵工艺举例二.种子复性将在液氮甘油管中冻存的基因工程菌种接种于装有20mLLB培养基（含Amp50mg/L和Kan20mg/L）的小试管中，37℃，200r/min的条件下过夜培养，次日接种于装有500mL培养基的摇瓶中，培养至菌体OD600值打到所需要求后，将其作为一级种子。第19页/共26页发酵工艺举例三.40L发酵罐发酵将40L发酵罐空罐灭菌后加入30L培养基（蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、氯化钠5g/L）进行实罐灭菌。冷却后将一级种子液接种于发酵罐中，节通气量和转速，维持溶氧在35%~80%，37℃培养。当菌体OD600打到5.3时，加入7mM的IPTG诱导rhG-CSFa表达。诱导1h后，加入2L已灭菌的5X培养基（蛋白胨100g/L、酵母膏100g/L、氯化钠25g/L）以补充营养。发酵过程中自动添加HCl和氨水，将发酵液pH维持在7.2左右。随时调节通气量和转速，保证溶氧维持在30%以上。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用.第20页/共26页发酵工艺举例四.发酵终止与产物分离

诱导4h后终止发酵，酵液利用工业化自动连续离心机离心收集菌体。

收集的菌体用裂解缓冲液（Tris50mmol/L、EDTA2mmol/L、NaCl100mmol/L、TritonX-1005%V/V、溶菌酶

1mg/mL、pH8.0）重悬，4℃搅拌至黏稠，超声波破碎菌体至不黏，离心（7000r/min，25min）获得包涵体，依次经过尿素缓冲液（Tris50mmol/L、EDTA2mmol/L、Urea2mol/L、pH8.0）和纯水洗涤后得到较纯的包涵体第21页/共26页总结①现在的对于重组人粒细胞集落因子

(rhG-CSF)的研究主要有两个方向：一个方向是对其发酵条件的优化；另一个方向是对其药理作用的研究。②生物药物占新药的比重越来越大，预计到2020年,生物制药产品有望占全球药品销售收入的1/3。③但是国内的发展水平不高。我们既要看到不足，也要看到看到机会。第22页/共26页参考文献[1]靳坤，李洋，李乾,等．我国生物制药研究进展及展望[J]．现代生物医学进展，2O12(2)：370—372，376.[2]孟和宝力高.生物技术专业发展趋势及设想[J].解放军医药杂志,2013,(1)[3]KaushanskyK.Lineage-specifichematopoieticgrowthfactors[J].NEnglJMed,2006,354(4):2034-2045.[4]莫红楠，石远凯，孙燕.重组人粒细胞集落刺激因子在肿瘤化疗中应用20年回顾[J].ChineseJournalofNewDrugs2013,22(17):2027-2032[5]DonadieuJ,FenneteauO,BeaupainB,etal.Congnitalneutropenia:diagnosis,molecularbasesandpatientmanagement[J].OrphanetJRareDis,2011,6:26.[6]石远凯，孙燕，等.基因重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子预防化疗所致白细胞减少症的临床疗效观察[J]中华肿瘤杂志，1994，16（5）：356-359.[7]ShiYK，ChenQ，etal.Pegylatedfilgrastimiscomparablewithfilgrastimassupportforcommonlyusedchemotherapyregimens：amulticener，randomized，crossoverphase3study[J].AnticanerDrugs，2013，24（6）：641-647.[8]王海波。重组人粒细胞集落刺激因子生产工艺的研究。西北大学，2002年，硕士论文。第23页/共26页参考文献[9]专利：CN101153278A[10]宋爽，蒋文宏，等。新一代重组人粒细胞集落刺激因子的工业化发酵、复性和纯化[J].中国生物医学工程学报,2012,31(4):552-557.[11]王娟，李希平。基因工程菌发酵表达rhG-CSF的条件优化[J]。药学研究，2014，33（7）：428-430.[12]郑剑，吴琳琳，李敏。乳糖诱导高分子量重组蛛丝蛋白发酵培养基优化[J].中国生物工程杂志，2008，28（1