液相色谱2011-6-20课件

2023年4月18日Agilent1200原理及结构2HPLC原理HPLC基本组成结构课程摘要一、液相色谱原理3溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

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GC与HPLC选择：小分子——热稳定性好——GC大分子——热稳定性差——HPLC

tR短GC优点：

g廉价灵敏度高

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HPLC的特点

1.高效分离n=105/米

2.高速使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟

3.高灵敏度检测下限：10-9～10-13g（最小检测量）

4.应用范围广可侧有机物75%～80%二、HPLC基本组成结构7手持控制器检测器柱温箱自动进样器泵脱气机

溶剂柜优化流路减小死体积流路自上而下指示灯状态9指示灯状态通过LED显示仪器六种状态：关机（未通电）就绪（已开机）未就绪正在运行出现故障驻存升级出现严重故障灯熄灭灯熄灭黄灯绿灯红灯黄灯闪烁红灯闪烁

102.1流动相要求：

1、与固定相不互溶，不反应。

2、对组分有适当溶解度。

3、纯度高，使用前需过滤、脱气。

4、粘度小（否则传质速度慢，柱效低，柱压高）

5、与检测器匹配。

112.1流动相脱气：

HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。若有气泡会影响（1）输液系统正常工作使压力不稳，tR变化。（2）进入检测器影响检测信号。连接方式：在线真空脱气机工作原理14流动相脱气吹氦脱气法加热回流法抽真空脱气法超声波脱气法在线真空脱气法使用真空脱气机可以保证保留时间的重现性17溶解酵素分析

2425262728296050403020100mAU第一次实验最后一次实验(30小时后)使用氦气脱气脱气机在线脱气2425262728296050403020100mAU最后一次实验(30小时后)第一次实验182.3四元泵的介绍特征/优点四通路/低压混合能灵活地进行等度或梯度洗脱。无需消耗昂贵的He而能进行高性能真空脱气。自动冲程调节，混合非常均匀，降低基线噪音。对于高盐流动相，可选择泵头密封垫清洗装置清洗密封垫。Agilent1200系列四元泵前视图19溶剂柜真空脱气机G1322A四元泵G1311A泵头结构图211.宝石活塞杆2.活塞外框架(包括弹簧)3.支持环4.泵头密封垫5.泵腔6.入口主动阀7.出口单向阀8.塑料锁定螺栓9.冲洗阀10.泵头固定螺丝Agilent1200单元泵和四元泵的阀22PTFEFrit:01018-22707镀金密封垫塑料出口盖出口单向阀入口主动阀过滤芯耐400bar5062-8562冲洗阀镀金密封垫塑料出口盖PTFE过滤芯Agilent溶剂传输系统——串连柱塞泵23单向阀脉冲阻尼器减少了单向阀用量同样需要阻尼器（减少压力波动）可以使用压缩因子补偿四元泵工作原理示意图252.4手动、自动进样器26标准自动进样器：G1329A标准自动进样器SL型：G1329B高性能自动进样器：G1367B高性能自动进样器SL型：G1367C高性能自动进样器SL+型：G1367D手动进样器：G1328BAgilent1200系列标准自动进样器30推荐…进样体积从0.1µL到100µL经过扩展，进样量可扩展至1800µL

最多可容纳100个样品瓶自动样品前处理性能/优点进样体积重复性高(典型RSD<0.5%)

进样动态范围宽连续冲洗流路并有洗针功能－降低样品残留所有驱动均采用电子驱动可以容纳不同规格的样品瓶灵活的进样程序编制可以进行样品前处理（例如柱前衍生）使用旁路可以降低延迟体积标准自动进样器进样过程31计量泵六通阀(旁路位置)Bypass定量环来自泵系统至废液口计量泵活塞杆回归零位针座毛细管去往色谱柱去往色谱柱来自泵系统计量泵抽取样品六通阀(旁路位置)Bypass来自泵系统去往色谱柱六通阀(主路位置)Mainpass1.六通阀切换到旁路位置2.计量泵活塞杆回归零位3.抬起进样针4.将样品抓至针座上5.针扎入样品瓶6.计量泵抽取样品7.针从样品瓶中拔出8.将样品瓶放回样品盘9.针扎入针座毛细管10.六通阀切换到主路位置Agilent1200系列标准自动进样器进样

测试32min05101520253035mAU020406080100#1#10#5#810µL样品，每次进样1µL，进样十次Agilent1200系列标准自动进样器特殊

功能33洗针功能把样品残留降低到最小限度多次吸液

用于进样量大于100µL的情况

程序进样可以非常灵活地执行用户的进样程序要求使用洗针功能可以降低样品残留34min510mAU04样品:0.01mol/L咖啡因,普里米酮，非那西汀进样量:1µL

洗针后的空白进样(1µL)不洗针后的空白进样(1µL)样品残留峰洗针对样品残留的影响（清洗瓶盖帽/不盖帽）35样品残留(%)进样体积(µL)00.050.10.150.20.250.30.350.10.515普里米酮00.050.10.150.20.30.350.10.515非那西汀0.25进样体积(µL)样品残留(%)不洗针洗针(不盖瓶盖)洗针(盖瓶盖)2.5Agilent1200柱温箱36特征/优点大空间，可以容纳三根长色谱柱更换柱子非常方便降温非常方便安装柱识别可以记录进样次数使用切换阀可以进行柱切换(可选)两个单独的加热区可以分别控制温度可以进行程序升温内部死体积小(左侧3µL，右侧6µL)推荐...温度控制范围：

低于室温10℃~80℃保留时间的再现性需要稳定

的温度如果需要在高于或低于室温

进行分离操作时，需要使用

柱温箱G1316A型柱温箱前视图

37来自自动进样器至流通池入口毛细管柱识别卡套柱切换阀泄漏传感器2.6Agilent1200检测器38Agilent1200系列检测器：可变波长检测器二极管阵列检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器Agilent1200可变波长检测器（VWD）39推荐…产品开发及质量控制应用需要高灵敏度检测器性能/优点...从190~600nm波长范围，噪音小，基线稳定(±0.75x10-5AU)*可变波长检测，可以对不同物质的检测获取最大灵敏度。更换氘灯及清洗检测池非常方便内