酶定向进化课件

第八章酶定向进化天然酶的局限天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能

天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.

现代生物工程的要求

能具备长期稳定性和活性

能适用于水及非水相环境

能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物

能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料

如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.

酶分子定向进化简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程随机突变、构建突变基因文库、定向选择酶定向进化的基本过程：酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行第一节酶定向进化的特点

1.适应面广不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。

2.目的性强3.效果显著第二节酶基因的随机突变体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术基因随机突变方法的特点P207表8－1可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。特点正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。二DNA重排技术概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术的基本过程两条以上正突变基因DNA随机片断突变基因构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶酶切（反复进行）无引物PCR基因重组酶切基因家族重排技术的基本过程基因家族若干同源基因酶切DNA随机片断突变基因突变基因文库基因重组筛选负突变基因正突变基因进化酶无引物PCR酶切反复进行DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。第三节酶突变基因的定向选择突变基因的定向选择基本过程突变基因基因载体突变基因文库基因重组筛选目的基因基因重组

在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接形成基因文库将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。二、突变基因的筛选（一）定向选择环境条件的设定（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。（二）高通量筛选技术P217表8－22）依据颜色变化筛选突变基因（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌β－半乳糖苷酶的基因片断（lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。（2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。3）依据透明圈情况筛选突变基因依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。第四节酶定向进化的应用P221表8－3，总结应用一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性提高酶分子的催化活力例如，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对L—天冬氨酸酶，进行定向进化研究、以提高催化活力。实例：L—天冬氨酸酶定向进化研究根据定向进化的基本思想，作者确定了易错PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验路线。共进行了4轮易错PCR，每一轮易错PCR约筛选了3000个菌落。最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产L—天冬氨酸。枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化