免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术

整理pptCK阳性肿瘤细胞组织来源（中间丝标志物）整理pptEMA阳性整理ppt肿瘤的病因和发病机理研究HBsAg阳性（病毒及癌基因标志物）整理ppt肿瘤细胞功能分类B细胞阳性（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志）整理ppt肿瘤癌前病变和早期诊断P53阳性（癌胚抗原或肿瘤相关抗原）整理ppt肿瘤病理诊断与鉴别诊断HMB45阳性（各种肿瘤特异性抗原）整理ppt肿瘤治疗和预后判断PR阳性（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志）整理pptCer-bB-2整理pptKi-67阳性整理ppt

第一节基本原理

整理ppt抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。整理ppt免疫酶组化免疫学(抗原抗体反应)

酶细胞化学(底物显色反应)+特异性敏感性定位性可视性整理pptPAP法整理ppt免疫酶组织化学基本组成：抗原↓抗体↓放大系统↓显色系统整理pptABC法整理ppt免疫酶特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广整理ppt第二节酶和底物整理ppt一、酶及其特点酶选择标准：

★该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。

★酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。整理ppt

★酶易于纯化，获得纯制品。

★酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。整理ppt

★酶在PH中性液内较稳定。★组织中不应存在与底物作用的内源性酶。整理ppt符合上述条件：

辣根过氧化物酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶整理ppt（一）辣根过氧化物酶（HRP）★分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位★稳定，易获得较高纯度酶★具有较高活性及特异性整理ppt★可溶性佳，生成的产物不扩散★组织中内源性酶较少★可作用于多种底物，产生不同颜色★HRP穿透力强，易进入细胞内整理ppt（二）硷性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取

●组织穿透能力较弱

●内源性AKP较高

●左旋咪唑具有抑制作用整理ppt（三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定

●体内无内源性GOD

●分子量大，穿透力较弱整理ppt二、底物及其特点酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色）整理pptHRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。整理pptHRP显色反应：HRP＋H2O2HRP＋H2O＋电子供体（氧化型）电子供体整理ppt电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。整理pptHRP常用的电子供体：●3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色●氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。整理ppt●4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存●3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)～黄色整理pptAKP底物：AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB～蓝色固红TR～红色整理ppt第三节酶标记抗体法整理ppt酶标记抗体法（EnzaymeLabelledantibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。整理ppt一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原---抗体●HRP复合物整理ppt组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法整理ppt步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。整理ppt二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原---特异性抗体---第二抗体●

HRP复合物步骤：二步法整理ppt组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法整理ppt特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。整理ppt第四节酶抗酶法

整理ppt●制备抗酶抗体●制备PAP复合物整理ppt酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP整理ppt一、PAP法原理：抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP复合物步骤：三步法整理ppt组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP整理ppt特点：

敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物整理ppt二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物整理ppt抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP---第二抗体---PAP复合物整理ppt组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP整理ppt双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP整理ppt步骤：五步法特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特异背景重整理ppt三、APAAP法原理：抗原---特异抗体---第二抗体---APAAP复合物步骤：三步法整理pptAPAAP法整理ppt特点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂整理ppt第五节卵白素---生物素法

整理pptAvidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力整理ppt一、ABC法AvidinBiotinComplex原理：酶标记Biotin形成酶素化Biotin整理ppt酶素化Biotin＋Avidin---ABC复合物抗原---特异抗体---Biotin标记第二抗---Avidin●Biotin●HRP整理ppt组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素ABC法整理ppt步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强，应用范围广整理ppt

●某些脏器存在内源性生物素干扰●Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应整理pptSABC法StreptavidinbiotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABC法整理ppt二、LSAB法LabelledStreptavidinBiotinMethod原理：●

Biotin标记第二抗体整理pptLSAB法整理ppt●HRP标记Avidin抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin●HRP复合物整理ppt步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强，方法简便整理ppt第六节多聚合物酶法整理ppt多聚合物酶法整理ppt

HRP---多聚合物---抗体

一、Epos法Enhancedpolymerone-stepstaining整理ppt组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS方法整理ppt原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP---多聚合物---特异性抗体。整理ppt步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵整理ppt二、EnVision法EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚合物---第二抗体整理ppt组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVisionTM方法整理ppt特点：敏感性高：（1mole复合物中含70moleHRP和10mole第二抗体）整理ppt特异性强：复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。整理ppt第七节基本操作步骤整理ppt＊抗原修复＊内源性过氧化物抑制＊正常血清封闭＊第一抗体整理ppt＊第二抗体＊酶标记体＊DAB-H2O2显色整理ppt第八节抗原定位及非特异染色

整理ppt组织细胞

＊固定问题

＊脱蜡不彻底

＊内源性过氧化物

＊内源性生物素整理ppt抗原

＊抗原弥散

＊抗原异常表达

＊共同抗原决定簇整理ppt特异性抗体

＊非特异吸附

＊抗体不纯

＊交叉反应整理ppt第二抗体

＊IgG交叉反应

＊二抗不纯整理ppt标记物

＊质量

＊纯度

＊标记水平整理ppt底物溶液

＊

DAB