医学细胞与遗传学教学课件：细胞衰老细胞死亡

干细胞与组织再生Stemcell&cellregeneration黄禹锡造假小保方晴子造假胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)在人胚胎发育早期—囊胚中含有未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群（innercellmass,ICM）。内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。ESC特点可在体外无限培养增殖长期保持原始未分化状态可分化出衍生于3胚层的各类组织细胞胚胎干细胞可以诱导分化为任何一种组织细胞胚胎干细胞的获得Thomson的工作:从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。Gearhart的工作：Gearheart从从终止妊娠的胎儿原本要发育成睾丸或卵巢的部位取得细胞。尽管Thomson和Gearheart使用的细胞系来源不同，但非常相似。

体细胞核转移将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞结构）。在实验室条件下将单个体细胞(除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞)与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能，因此是全能性的。

胚胎干细胞的主要特征形态：体积小、核大、紧密堆积，无明显细胞界限生化：胚胎阶段特异性抗原（stage-specificembryonicantigen，SSEA）端粒酶活性高分化能力强，可在体外长期培养将ESC注射到裸鼠皮下，小鼠可产生畸胎瘤。分化的胚胎组织包括胃上皮组织(内胚层),骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌(中胚层)，神经表皮、神经节和复层鳞状上皮(外胚层)等。动物模型：嵌合体小鼠为什么进行胚胎干细胞研究干细胞技术的市场前景研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。优点明显应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：低毒性（或无毒性），一次给药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。存在的问题ESC的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达，以实现分化抑制，保证细胞的全能性。ESC在体外需在饲养层(feederlayer)细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。

选择合适培养基，添加LIF（小鼠ES细胞

）

LIF是目前唯一明确的保持小鼠干细胞特性的重要细胞因子，维持其增殖状态。LIF-STAT信号通路图如何定向诱导干细胞分化？--细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程，因而要诱导产生某种特异类型的组织，需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这如何克服移植排斥反应对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性尚需做全面、客观、深入的评价。人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德，应用过程中所产生的伦理及法律问题如何处理。

研究表明人体脂肪、胎盘等组织中的干细胞，具有惊人的可塑性，和胚胎干细胞一样，可以分化成各种各样的组织细胞，可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育，然后将其移植回病人体内，这样既可以避免发生排斥现象，也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞。成体干细胞的不足之处：人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞，例如人们尚未发现人类的成体心脏干细胞。成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低。在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植。成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力。由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等。iPS细胞（inducedpluripotentstemcells）2006年Yamanaka发现，胚胎干细胞中存在一系列特异性表达的蛋白质，而当胚胎干细胞分化时，这些蛋白表达减少。提出如果在小鼠体细胞内表达这些蛋白，或许能使体细胞转变为具有干细胞全能性质的细胞。经过研究发现可使用病毒载体将Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4等转录因子导入到小鼠皮肤成纤维细胞，形成具有干细胞形态的细胞群落。这些细胞群落具有SSEA，也通过畸胎瘤形成等其他干细胞指标检测，充分证明了它们具有多能性。Oct4，Sox2被证明是维持干细胞状态所必需的因子，而另外两个因子更多起到的是促进转化和抑制凋亡的作用。Oct4,Sox2,c-Myc

、Klf4或Oct4,Sox2,Nanog

、Lin28

→Oct4、Klf4或c-Myc（神经细胞）→Oct4（鼠神经干细胞）→？这一发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。2008.4，美国科学家将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。2009.2，日本科学家宣布成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且声称从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。2010.6，美、日的三个研究小组分别实现了将人体血细胞转化为iPS细胞。iPS细胞与胚胎干细胞相比有很多优点：iPS细胞则由体细胞诱导产生，不存在来源的问题。iPS细胞取自病人组织，产生的是病人特异的干细胞，避免了免疫排斥反应。iPS细胞缺点：c-myc是原癌基因，此基因的失控会导致癌症的发生。iPS小鼠存在明显的健康问题，死亡率很高。慢病毒载体的使用也会导致基因组的整合，诱发致癌危险。iPS在研究和应用上都面临着很多的挑战，解决这些问题将促进iPS细胞在临床治疗中的研究及应用。2014年12月，针对“STAP细胞”的相关调查认定，小保方晴子的“万能细胞”--“STAP细胞”在制备过程中混入了胚胎干细胞（ES细胞）。细胞衰老

&细胞死亡衰老（aging，senescence）指在正常状况下生物发育成熟后，随年龄增加，自身功能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，各结构、组分逐渐退行性变，趋向死亡的不可逆过程。细胞衰老个体衰老建立在细胞总体衰老的基础上，各种衰老表现均有其细胞生物学基础。组成人体组织的细胞寿命有显著差异，保持继续分裂能力的细胞不易衰老。细胞衰老的体外实验

利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养后发现：胚胎的成纤维细胞分裂传代50次后开始衰退和死亡，成年组织的成纤维细胞培养15～30代就开始死亡。

常可用胚胎成纤维细胞体外培养的群体倍增次数估计个体的寿命。主要表现在对外界环境变化的适应能力降低和维持细胞内稳态的能力的降低，相应的也就出现了形态结构与生化功能上的改变。细胞衰老的表现由于水分丢失使得体积缩小，细胞“硬化”并失去正常形态。核膜内陷，核固缩，染色质固缩化

，核质比例减小。溶酶体清除功能下降（色素沉积）。蛋白质合成下降，变异蛋白出现；酶活性丧失。总的复制转录活动受抑制，但个别基因异常激活；染色体端粒缩短；线粒体也有异常改变。mtDNA突变增加。膜脂成分改变，流动性降低，跨膜进行物质运输与信号转导发生障碍，机械抗性降低。细胞分裂增殖能力降低。遗传物质的影响－－衰老相关基因活化、损伤或片段缺失的积累、端粒影响细胞分裂的次数（当端粒缩短到临界长度时细胞不再分裂）氧化损伤（自由基）对细胞的伤害(破坏核酸、脂质、蛋白质结构）衰老的原因根据细胞死亡模式的不同，可将其分为两种类型：坏死（necrosis）与凋亡（apoptosis）细胞死亡坏死指的是病理性死亡。当外界因素超过细胞所承受的强度阈值时，会导致细胞结构和功能的快速崩溃，细胞肿胀膨大，胞膜/核膜破裂，细胞器/核内物质散失，往往伴随炎症反应。是一种被动性死亡。

坏死（necrosis）左图：正常肝脏结构，肝小叶清晰，细胞完整。右图：肝炎侵袭后肝脏

，肝细胞明显肿大坏死。（空泡样结构是水肿的肝细胞，深色黑点是开始或已经坏死的肝细胞）

也称程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD），是细胞在一定条件下遵循一定程序主动性死亡的过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。凋亡(apoptosis)细胞表面结构改变；内质网膨胀与细胞膜融合。细胞骨架逐渐断裂，胞膜塌陷，细胞体积缩小。染色质向核膜聚集，逐渐形成新月形致密斑（“核固缩”）。核膜向内塌陷，细胞核断裂并被分割包被。细胞凋亡的特点细胞膜的内陷把细胞质分隔包裹，形成凋亡小体（apoptoticbody

）。凋亡小体内细胞器结构完整，线粒体、溶酶体无变化，始终有膜封闭，内溶物无释放，故不会引起炎症。凋亡细胞DNA电泳，可以出现特征性的梯状DNA条带（核酸内切酶活化，连接DNA断裂）。细胞膜表面的各种蛋白质－糖链结构的改变（膜内侧的磷脂酰丝氨酸暴露于外侧）会被周围细胞探测到，最后由巨噬细胞把凋亡细胞吞入水解，最终完成细胞凋亡的全过程。细胞坏死与凋亡的形态区别细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性

病理性变化或剧烈损伤基因调节受相关基因调控与基因调节无关细胞体积固缩变小肿胀变大细胞膜保持完整，直至形成凋亡小体破损细胞器完整，内质网与细胞膜融合肿胀，甚至崩解细胞核染色质凝集，在核膜下呈半月状染色质弥散，核膜破裂，核内物质丢失基因组DNA核酸内切酶活化，DNA降解为特定长度，电泳图谱呈梯状随机降解为任意长度，电泳图谱呈弥散状凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无蛋白质合成合成特定蛋白质无炎症反应无，不释放细胞内容物

有，释放细胞质内容物范围单个散在细胞成群细胞，伴组织纤维化生物学意义：参与影响胚胎发育清除衰老、受损细胞，维持体内环境稳定参与免疫应答过程参与某些年龄相关疾病的发病（阿尔茨海默病）

细胞凋亡的形态学检测光学显微镜/荧光显微镜／膜联蛋白-V／线粒体检测电子显微镜观察：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。DNA片段化分析：细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。细胞凋亡的机制SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston2002NobelPrize：fortheirdiscoveriesconcerning"geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath"线虫(C.elegans)

凋亡相关基因细胞凋亡的调控涉及许多基因。其中研究较多的有ced、Bcl-2、p53、Fas/APO-1、c-myc、ICE等。线虫的细胞凋亡与凋亡直接相关：Ced-3、Ced-4、Ced-9.与凋亡细胞被吞噬细胞吞噬相关：ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-8和ced-10。与凋亡细胞DNA降解相关：nuc-1。以线虫为起点，包括caspase、bcl、p53等在内的与人类细胞凋亡调控有密切关系的基因也陆续被发现。Caspase家族Caspase是Ced-3的同源物，是引起细胞凋亡的关键酶，C端同源区存在半胱氨酸激活位点，靶蛋白的切割位点均在天冬氨酸残基。非活性的caspase均以酶原形式存在，被信号途径激活后，产生caspase级联反应，将细胞内的蛋白质降解。根据级联反应中所处的位置，caspase可分为位于上游的起始蛋白和位于下游的效应蛋白。启动凋亡：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10

凋亡执行：Caspase3，Caspase6，Caspase7起始蛋白被激活后对效应蛋白进行切割并使之激活，随后级联反应递次激活下游的caspase。对靶蛋白的水解最终导致程序性细胞死亡。Bcl-2家族

Bcl-2家族蛋白可调节线粒体膜的通透性，促凋亡蛋白Bax增加通透性，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2阻止Bax效应。p53自杀相关因子（factorassociatedsuicide,Fas)与FasL凋亡的信号传导各种内外因素可以启动细胞凋亡，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体介导的细胞凋亡细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配体属于TNF家族。均具有富含半胱氨酸的胞外区和含死亡结构域（Deathdomain，DD）的胞内区。Fas与FasL活化的caspase-8、10启动caspase的级联反应，使caspase-3、-