Realtime PCR实验原理与技术

实时荧光定量PCR实验原理与技术胡晓研究生实验技术2015-12-7现在是1页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术原理一、实验原理：在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光信号

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标准曲线定量分析？现在是2页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术原理Ct值(CycleThreshold;每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。（定量分析）现在是3页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术荧光标记方法的分类非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。

常用染料：PicoGreen（灵敏度高,>=25pg/mL）SYBRI缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。

现在是4页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术荧光标记方法的分类现在是5页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术荧光标记方法的分类2.特异性荧光定量PCR:以荧光共振能量转移原理为基础水解探针法分子信标Scorpion引物/探针复合探针现在是6页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术影响因素样品RNA的完整性RNA样品中的基因组DNA污染特异性良好的引物PCR反应体系的优化反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量可靠的内标基因：TEF-2现在是7页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作现在是8页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作阳性模板现在是9页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作制作标准品阳性对照：测定阳性模板的浓度，10倍稀释为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下:(标准品反应体系)序号反应物剂量SYBRGreen1染料

10μl阳性模板上游引物F0.5μl阳性模板下游引物R0.5μldNTP0.5μlTaq酶

1μl阳性模板DNA5μl

ddH2O32.5μl总体积

50μl3.轻弹管底将溶液混合，短暂离心。(内参照基因反应体系)

序号反应物剂量

SYBRGreen1染料10μl内参照上游引物F0.5μl内参照下游引物R0.5μldNTP0.5μlTaq酶

1μl待测样品cDNA5μlddH2O32.5μl

总体积

50μl现在是10页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作1、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板：①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2

MgCl2溶液

1.5ul3

上游引物F0.5ul4

下游引物R0.5ul5dNTP混合液

3ul6Taq聚合酶

1ul7

cDNA

1ulddH2O

至25ul②轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）;72ºC延伸5分钟。③PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。④将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。现在是11页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作待测样品的待测基因实时定量PCR:①所有cDNA样品分别配臵实时定量PCR反应体系。体系配臵如下：序号反应物剂量SYBRGreen1染料10ul上游引物

1ul下游引物

1uldNTP1ulTaq聚合酶

2ul待测样品cDNA

5ulddH2O30ul

总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。现在是12页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作上机前样本的制备检测程序的设置检测孔及相关参数的设置热循环参数的设置运行检测程序结果的显示与输出结果分析熔解曲线扩增曲线现在是13页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作现在是14页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）现在是15页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）现在是16页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）假阳性：荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲线分析。熔解曲线峰为单一峰形，未见其他峰值，并且峰的形状也比较锐利。扩增产物特异性好。现在是17页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）有研究建议在每一个循环中PCR延伸后增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度大于引物二聚体的退火温度Tm，而小于特异性扩增产物的Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性PCR产物结合的SYBRGreenI所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。现在是18页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）标准品的选择：

理论上可以以目的基因的PCR扩增产物为标准品，但是存在降解、污染等因素影响定量结果。论坛网友给出了几种解决方法：另设计一对引物用于荧光PCR；将扩增序列插入T载体后作为标准品；设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(①+②)现在是19页\一共有24页\编辑于星期一qRT-PCR技术实验操作（优化）现在是20页\一共有24页\编辑于星期一现在是21页\一共有24页\编辑于星期一半定量PCR1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差现在是22页\一共有24页\编辑于星期一半定量PCR实验过程总RNA提取；模板cDNA制作；半定量PT-PCR：现在是23页\一共有24页\编辑于星期一半定量PCR优化步骤引物设计及选择：