二代测序NGS培训班课件 2傅启华 NGS应用于遗传性疾病分子诊断（福州）

下一代测序技术

在遗传性疾病分子诊断中的应用

上海交通大学医学院儿科转化医学研究所上海儿童医学中心精准医疗实验诊断中心傅启华OMIM共收录约7000种遗传性疾病;虽然单个遗传性疾病的发病率并不高（因此通常称之为罕见病），但总体发病率并不低;罕见病（raredisease）：受累患者数量少于200,000（美国）遗传性疾病的分类及发病率遗传性疾病患者总体数量大缺乏准确的流行病学基础信息诊断率低逐渐引起重视我国已开始加快遗传性疾病相关研究工作遗传性疾病基因检测的目的性分类新生儿筛查：PKU、CAH诊断性检测：骨病、地贫携带者筛查：地贫、HA预见性检测：癌、心血管症状前检测：亨廷顿病、阿尔茨海默病“Nextgenerationsequencing”PubmedsearchingthismorningIonTorrent测序技术NGS实验主要涉及三个步骤:测序文库制备,测序及数据分析Contributionofdifferentfactorstotheoverallcostofasequencingprojectacrosstime下一代测序实验数据分析流程原始测序数据处理发现遗传变异变异信息的高级分析3,000,000-4,000,000variants20,000-50,000variants5,000variants150-500VariantspresentinagenomeVariantsinanexomeVariantsaftercallingqualityrecalibratedVariantsafterdbSNP,TG,ESP,andin-housedatabasefilteringPutativecausalvariants(Biologyanalysis)全外显子组测序数据分析各阶段的变异数量变异的筛选策略Gilissenetal.EurJHumGenet.201220(5):490-497变异分类及报告策略临床分子诊断遗传变异结果报告和解释中常用资源下一代测序（NGS）已逐渐应用于临床分子诊断不同规模的NGS实验在临床分子诊断中的应用全基因组测序（Genome）：产前诊断全外显子组测序（Exome）：发现、鉴定致病基因靶向目标基因测序（Panel）：临床分子诊断FortheFirsttime:Whole-GenomeSequencingDeliversNewTreatmentOptionsforTwinswithRareGeneticMovementDisorderNGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(1)将NGS技术作为常规诊断试验进行候选基因突变筛查对于神经肌肉系统疾病患者的临床诊疗和遗传咨询具有重要价值NGS在神经肌肉系统疾病分子诊断中的应用(2)DMD和BMD是最常见的NMDDMD基因巨大，常规方法难度大89例DMD和BMD患者，18例女性携带者和245例非DMD患者CNV：99.99%精确性

和98.96%敏感性SNV：100%准确率9例患者发生部分外显子缺失，可知精确断裂位置信息NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（1）作者病例数基因数临床诊断基因诊断率Neveling,etal.100111视网膜变性36%Audo,etal.20254遗传性视网膜病家系57%Bowne,etal.2146常染色体显性遗传视网膜变性家系24%Glockle,etal.170105遗传性视网膜营养不良55%～80%Wang,etal.123163视网膜变性37%Fu,etal.31163常染色体隐性视网膜变性家系40%较之传统的分子诊断方法（如采用Sanger测序技术逐个基因进行分析），NGS能够有效提高各种类型视网膜疾病分子诊断的能力和效率；同时能有效减低分子诊断的费用NGS在视网膜疾病分子诊断中的应用（2）Glockle,etal.EurJHumGenet(2014)22,99–104105个已知视网膜疾病致病基因组成的NGS诊断panel107例临床未经筛选的视网膜疾病患者视网膜变性患者的分子诊断率：55%Bardet–Biedl综合征或Usher综合征患者：80%均发现致病或候选致病变异NGS在血液系统疾病分子诊断中的应用NGS已成功应用于范可尼贫血、VWD等血液系统疾病的分子诊断NGS在遗传病携带者检测中的应用利用NGS技术，能对严重影响儿童健康的遗传病进行全面、系统筛查NGS在线粒体疾病分子诊断中的应用42例经常规基因检测未能诊断的婴儿型线粒体病此panel包含线粒体基因组、100个已知线粒体病致病基因及1000个与线粒体功能相关基因与正常人相比，患者群体中具有功能影响的变异（罕见变异、影响蛋白功能的变异及隐性遗传的变异）负荷增加了5倍55%存在隐性基因突变或致病性线粒体基因突变：10例（24%）患者进行明确的分子诊断；

13例（31%）患者出现核基因突变，其中2例患者的突变经功能研究发现可疑引起线粒体病Baby’sDNAinmother’sbloodNGS在产前诊断中的应用利用NGS技术对孕妇外周血中的cfDNA进行无创产前诊断（noninvasiveprenataltesting,NIPT）已成为该领域的发展趋势基于孕妇外周血无细胞血浆胎儿DNA的无创产前诊断的21三体（0.3%vs.3.6%,P<0.001）和18三体（0.2%vs.0.6%,P=0.03）的假阳性率远低于传统的产前筛查NIPT能够检出全部携带常染色体异倍体的孕妇，阴性预测值为100%（95%CI：99.8%～100%）同时，NIPT对21三体（45.5%vs4.2%）和18三体（40.0%vs8.3%）的阳性预测值显著高于标准筛查方法可以作为常染色体异倍体筛查的一线方法NEnglJMed.

2014Feb27;370(9):799-808WES用于出血病患者的分子诊断病人资料患者，女性，临床类似血友病出血表现用凝血酶原复合物治疗有效DIC、凝血因子活性检测均正常VWD排除血小板功能正常其弟与其有相似的临床出血表现，父母为近亲婚配遗传性出血性疾病（凝血因子功能缺陷？）NGS结果631A>C,211T>P

F10基因表型诊断APTT:

50.2sFⅤ:124.9%PT:

11.3sFⅧ:76.7%INR:

0.98FⅪ:118.7%FIB:

3.71g/LFⅫ:80.7%FⅡ:

109.8%FⅦ:

100.4%FⅨ:72.0%FⅩ(PT法):

108.3%FX:C（APTT法）=4.36%病人凝固时间=76.7sThrombHaemost.2013Jul;110(1):53-61.

发色底物法：FX:C=109.4%病人OD405=0.3565远端关节屈曲畸形远端关节屈曲畸形（Distalarthrogryposis，DA）是一种先天性多发性关节挛缩畸形遗传病，主要表现为2个或2个以上关节的挛缩畸形，并且不包括神经和肌肉疾病所导致的关节畸形。典型的临床特点：手部关节屈曲畸形、手指重叠及手指向尺侧测斜；马蹄内翻足，仰趾外翻足，垂直距骨；腕关节、肘关节、膝关节等先天性屈曲伴活动受限，髋关节脱位等。目前，至少将DA分为10种亚型，所有DA亚型具有一些共同的表现：手足均受累及、近端关节较少受影响、表现度（expressivity）不一DA致病机制迄今，已鉴定出至少10个基因突变与DA有关TypeGeneDA1TPM2,MYBPC1,TNNI2,MYH3DA2AMYH3DA2BTNNT3,TNNI2,MYH3,TPM2DA3PIEZO2DA5PIEZO2,ECEL1DA6FGFR3DA7MYH8DA9FBN2案例先证者为2岁男孩，其父母非近亲婚配。出生后即发现双手双足畸形，但生长发育未见明显异常，于2012年10月上旬到我院骨科门诊就诊。骨科门诊检查发现先证者双手挛缩，双手拇指内收且拇指比正常长，不能伸直，但双手具备基本功能；双足挛缩，不能走路，其余检查未发现明显异常。先证者姐姐同样具有先天性双手双足畸形，且双足已经手术矫正但效果欠佳；先证者父亲患有双手畸形，双足正常，余无殊。先证者母亲G3P2，头胎女儿出生后即死亡，但死婴是否患有此类手足畸形情况不明。患儿母亲孕期正常，为自然顺产。先证者父母否认双方亲属有遗传病史。先证者及其受累家系成员经过详细体检和检查均未发现其他明显异常。MoleculardefectidentifiedbyWESinapedigreeofdistalarthrogryposis共得到286个候选致病变异初步确认TNNI2基因（NM_003282）c.533T>G（p.F178C）是该家系的致病突变是TNNI2基因的新突变。该变异经Sanger测序验证，并与疾病表型完全共分离TNNI2c.533T>G,p.F178CF178C突变位于TNNI2蛋白的C-末端，位点具有高度进化保守性phyre2工具分析表明，该突变可导致TNNI2蛋白二级结构的改变诊断DA是一组临床表现和遗传病因均高度异质的疾病。同时，由于不完全外显、表现度不一、不同DA亚型存在临床表现的重叠以及缺乏对不同亚型自然病程的了解，对DA的鉴别诊断和分型、尤其是DA1、DA2B/SHS和DA2A/FSS造成很大的困扰。实际上，相同亚型的DA患者其临床表现也各不一样，甚至在同一个DA家系中多个患者罹患不同亚型的DA，因此为DA1、DA2B和DA2A是同一种疾病的连续表现形式这一认识提供了证据。在本研究中，先证者及先证者姐姐均表现双手手指屈曲畸形、大拇指偏长、双马蹄内翻、不能行走、小下颌畸形；此外，未见嘴唇撅起、明显鼻唇沟、短颈、矮小、智力低下、小嘴等异常表现。先证者父亲仅出现双手手指屈曲畸形，未见其他明显可见异常表现。根据该家系临床表现特点，我们最终将其诊断为DA2B。NGS应用于疾病基因诊断存在的问题基因变异致病性的确定（缺乏统一、精确注释、经审核的基因型-表型数据库;文献报道中有27%的致病变异实为多态性或注释错误Sci.Transl.Med.2011,3,65ra4）偶然发现结果的报告（ACMG指南及引发的争议）二代测序实验中目的片段测序的不完整性（可能丢失致病性变异）缺少非编码区域致病性变异的发现工具和知识利用NGS进行遗传病分子诊断的质量控制在应用NGS进行遗传病的分子诊断过程中，必须对NGS实验和数据分析的各个方面进行严格的质量控制以保证结果的真实、可靠ArchPatholLabMed.doi:10.5858/a