薄层色谱法医学知识专家讲座

薄层色谱法薄层色谱法医学知识专家讲座第1页薄层色谱法（

Thinlayerchromatography，TLC）薄层色谱法,又称薄层层析（《中国药典》年版四部通则0502薄层色谱法），系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成份分离，所得色谱图与适宜标准物质按同法所得色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于判别、检验或含量测定。薄层色谱法医学知识专家讲座第2页薄层色谱法是快速分离和定性分析少许物质一个很主要试验技术，也用于跟踪反应进程。薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快。尤其适合于挥发性较小或较高温易发生改变物质分离。薄层色谱经常被用于探索柱层色谱分离条件和监测柱层色谱过程。薄层色谱在药品食品检验、化工化学、临床医学、农药残留检测等领域得到广泛应用。薄层色谱法医学知识专家讲座第3页一、发展历史

1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一个天然药品。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，促进了这一技术发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，各步操作实现了仪器化，并实现了计算机化。发展起来至今，仍被广泛采取。概述薄层色谱扫描仪薄层色谱法医学知识专家讲座第4页二、基本原理薄层色谱法是一个吸附薄层色谱分离法，它利用各成份对同一吸附剂吸附能力不一样，使在流动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）过程中，连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而到达各成份相互分离目标。薄层层析可依据作为固定相支持物不一样，分为薄层吸附层析(吸附剂）、薄层分配层析（纤维素）、薄层离子交换层析（离子交换剂）、薄层凝胶层析（分子筛凝胶）等。普通试验中应用较多是以吸附剂为固定相薄层吸附层析。液-固吸附薄层色谱法医学知识专家讲座第5页三、仪器与材料①薄层板按支持物材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等；固定相中可依据需要加入粘合剂、荧光剂等辅助物；可使用预制板或在确保色谱质量前提下试验室自制薄层板。用于制备薄层板玻璃板要求表面光洁，平整，最好使用厚度为l-2mm优质平板玻璃，普通窗玻璃普通不宜用于制作薄层极，玻璃板需用洗液或碱液洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用；重复使用时应注意需再用洗液或碱液清洗，如选取预制板应注意生产厂家提供相关参数，挑选，检验并试用是否符合要求。

薄层色谱法医学知识专家讲座第6页常见固定相种类：

硅胶—为使用最广泛薄层材料氧化铝—有碱性、中性、酸性硅藻土—为化学中性吸附剂纤维素—天然多糖类聚酰胺—特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键物质有尤其选择性

纯度高，含杂质少；粒度，结构均匀一致，有一定比表面积；在展开剂中不溶；与展开剂和样品组分不发生化学反应；含有适当吸附能力；机械强度和稳定性。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10-40μm）和高效薄层板（5-10μm），试验室自制板固定相粒径普通要求10-40μm。固定相要求：薄层色谱法医学知识专家讲座第7页试验室应用最广泛为硅胶薄层板。惯用类别有：

硅胶H：不含石膏黏合剂硅胶G：含煅石膏（硫酸钙）粘合剂硅胶S：用5%淀粉作黏合剂硅胶：用羧甲基纤维素（CMC）作黏合剂硅胶GF254：含煅石膏和一个无机荧光剂，即锰激活硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。

硅胶：化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。薄层色谱法医学知识专家讲座第8页②点样器普通采取微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。微升毛细管惯用规格有0.5ul，1.0ul、2.0ul、3.0ul、4.0ul、5.0ul及10ul等。对点样用微升毛细管要求是标示容量准确，管端平整光滑，管壁洁净，液流通畅，无堵塞，无污染，也可选取色谱用微量注射器（应选取针尖平头适合薄层点样）。微升毛细管半自动点样器材全自动点样器薄层色谱法医学知识专家讲座第9页③展开容器薄层色谱展开方式按几何类型份为：线型、环型和向心型。（a，b）线型（c）环型（d）向心型环型与向心型展开为特殊情况需求，需要借助特殊展开仪器进行展开；线型依据展开方向不一样可分为上行展开、下行展开、双向展开，水平展开，试验室普通使用为线型上行展开与水平展开。上行展开普通可用适合薄层板大小专用平底或双槽展开缸，展开式必须能密闭。水平展开用专用水平展开槽。平底、双槽展开缸水平展开室薄层色谱法医学知识专家讲座第10页流动相（展开剂）要求：①正确所需成份有良好溶解性；②可使成份间分开；③待测组分Rf在适当范围之间（除另有要求外，在杂质检验时，各杂质斑点比移值Rf以在0.2-0.8之间为宜）；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。流动相选择：

普通惯用溶剂按照极性从小到大次序排列大约为：石油迷<己烷<苯<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇

依据被分离物极性，先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强溶剂，如乙醇、丙酮等；假如Rf值太大，则加入适量极性弱溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定百分比酸或碱,使斑点集中。薄层色谱法医学知识专家讲座第11页流动相选择与使用时需注意问题：许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，造成试验难以重现。溶剂储备时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。对于易挥发溶剂，难于配制稳定组成流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。混合流动相组分要充分混匀形成均相。一些溶剂如氯仿、乙醚普通含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。薄层色谱法医学知识专家讲座第12页④显色装置薄层极展开后，有需用试剂（显色剂）显色。涂布显色剂有喷雾法和浸渍法，以及熏蒸法。喷雾法显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体是显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍法显色可用专用玻璃器械或用适宜展开缸代用，将展开后薄层板平稳放入有显色剂浸渍槽中数十秒至1分钟后取出（指净薄层板背后残余试剂）显色；熏蒸法显色可用双槽展开缸或适宜大小干燥器代替。玻璃喷雾瓶薄层色谱法医学知识专家讲座第13页显色剂能够分成两大类：一类是检验普通有机化合物通用显色剂;另一类是依据化合物分类或特殊官能团设计专属性显色剂。通用显色剂惯用有一定百分比硫酸-水溶液、硫酸-甲醇或乙醇溶液等，喷后110℃烘烤，不一样有机物有不一样显色；碘蒸汽熏蒸，

对很多化合物显黄棕色；5%磷钼酸乙醇溶液喷后120℃烘烤，还原性化合物显蓝色等。专属性显色剂因为化合物种

类繁多，所以专属性显色剂也是很多，以下是列举几例惯用专属性显色剂：改良碘化铋钾，对含氮有机化合物，如生物碱等显色，结果：呈橙红色斑点；茚三酮，对氨基酸、胺与氨基糖类等显色，结果：呈红紫色斑点；磷钼酸乙醇液，喷后在140℃加热5～10min，皂苷元均显深蓝色。

薄层色谱法医学知识专家讲座第14页⑤检视装置为装有可见光、254nm和365nm紫外光源及对应滤光片暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像。暗箱内光源应有足够光照度。紫外光灯长波段（365nm）和短波段（254nm）紫外光管：前者用于观察含有荧光色谱，后者普通用于观察硅胶GFS254薄层板色谱，黄绿色荧光背景下出现暗蓝紫色吸收斑点，选取紫外光灯应注意荧光管功率和滤光片性能。

365nm紫外光检视例图254nm紫外光检视例图薄层色谱法医学知识专家讲座第15页⑥薄层色谱扫描仪系指用一定波长光对薄层板上有吸收斑点，或经激发后能发射出荧光斑点，进行扫描，将扫描得到谱图和积分数据用于物质定性或定量分析仪器。薄层扫描仪不但能够进行原位定量，薄层扫描全图谱对定性判别也能提供有用信息。薄层色谱扫描仪薄层色谱法医学知识专家讲座第16页四、操作方法①薄层板制备市售薄层板（预制板）临用前普通应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不许活化。预制薄层板分常规薄层板及高效板两种，因为商品供给起源不一，需注意并统计生产厂家及生产批号，必要时需测定板效，以确保很好重现性。在质量确保前提下，应尽可能选取预制薄层极，以提升时效和色谱重现性。自制薄层板除另有要求外，将1份固定相（如硅胶G）和3份左右水（或加有粘合剂水溶液，如0.2%-0.5%CMC-Na水溶液，或要求浓度改性剂溶液）在研钵中沿同一个方向充分研磨混合，去除表面气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器，使硅胶浆均匀地涂布，薄层厚度普通为0.2～0.3mm，涂布好薄层板于室温下水平台上晾干，再于110℃加热活化约30分钟，置干燥器中备用。使用前应在反射光和透射光下检验板面及纹理是否均匀，如不均匀，有气泡或有麻点、有破损或已污染（如灰尘、纤维）者应弃去不用。薄层色谱法医学知识专家讲座第17页②点样

除另有要求外，在洁净干燥环境下，用点样用微升毛细管（或其它符合要求点样工具）点样与薄层板上。普通为圆点状或窄细条带状，点样基线与底边距离，视所用板大小而定，如采取长度为10cm板，点样距离底边以10-15mm为宜，高效板普通8-10mm。圆点状点样直径普通小于4mm，高效板小于2mm。如样品容量较大，或为了改进分离度，也可点成条带状，条带状宽度普通为5-10mm，高效板条带宽度普通为4-8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜。点样时须注意尽可能不要损害薄层表面。普通自制硅胶G薄层板，板面牢度不够，定量测定时需尤其注意小心点样，不要使原点部分板面破损。

薄层色谱法医学知识专家讲座第18页③展开点样后薄层板置入加有展开剂薄层展开箱中，密闭，普通采取上行展开，薄层板浸入展开剂深度普通要求溶剂最初前沿距原点约5mm，展开至要求展开距后马上将薄层权取出，晾干，以备检测。展开距离为8-15cm为宜，高效板5-8cm为宜。

如要求需用展开剂或其它溶剂蒸气预平衡者可在双槽展开箱一侧加入适量溶剂，密闭，普通保持15-30分钟。溶剂蒸汽预平衡后，应快速放入载有供品薄层板，马上密闭。如需到达饱和状态，可在展开箱内壁贴一被溶剂湿润滤纸使展开箱易于被蒸气平衡。如要求薄层板需要同时预平衡者，应将薄层板放入箱内没有溶剂一侧槽中，平衡后再将溶剂倾入此糟中展开（如图）。

必要时，可进行二次展开或双向展开，进行第二次展开前，应使薄层板残留展开剂完全挥干。

展开剂要求新鲜配制，如需分层则按要求要求放置分层后，分取需要一相（上层或下层）各用。同时预平衡薄层色谱法医学知识专家讲座第19页④显色与检视

有颜色物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸渍法以适宜显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。有荧光物质或显色后可激发荧光物质可在紫外光灯（365nm或254nm）下观察荧光斑点。对于在紫外光灯下有吸收成份，可用带有荧光剂薄层板（如硅胶GF254板），在紫外光灯（254nm）下观察荧光板面上荧光物质淬灭形成斑点。注意事项：使用喷雾法喷洒显色剂时注意用喷雾器均匀喷洒于薄层板面；浸渍法板面显色均匀是其优点，但有样品经试剂浸渍后斑点轻易被浸润扩散，则不适用；涂布试剂后如加热显色需注意控制加热温度和时间，尤其含羧甲基纤维素钠薄层板温度过高或加热时间过长易焦化，如用硫酸等试剂则可使板面碳化而影响显色效果；有成份加试剂后加热温度和加热时间不一样，显色效果可能有差异；有品种用蒸气熏蒸（如碘蒸气）显色者，可在密闭器皿中放置适当初间至斑点显色清楚。薄层色谱法医学知识专家讲座第20页⑤统计薄层色谱图像普通可采取摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像形式保留，也可用薄层色谱扫描或其它适宜方式（如薄层色谱原始统计）统计对应色谱图。薄层色谱法医学知识专家讲座第21页五、影响薄层色谱分析主要原因

常规薄层色谱因为是一个"敞开系统"色谱技术，与柱色谱区分之一是除材料及器材以外，外界环境条件对被分离物质层析行为影响很大，分离机制也很复杂；操作技巧也显著影响色谱质量；为了充分发挥薄层色谱技术在中药分析方面优势，提升色谱分离度和重现性，注意控制影响色谱质量原因是非常主要。以下所述几个方面不但对定量分析是必须注意问题，对提升定性分析质量也是不可忽略。薄层色谱法医学知识专家讲座第22页①样品预处理及供试液制备

普通认为薄层色谱所用固定相（薄层板）可即用即弃，不怕供试液中杂质污染，因而样品无需净化精制。但在实践中，因为中药成份复杂，未知成份多，供试液中溶出物质较多，其中现有欲测成份也有其它“杂质”。经常因为相互干扰或背景污染而难以得到满意分高效果，甚至难以识别。

所以在许多情况下为了得到一个较为清楚色谱，样品提取物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个主要有时甚至是关键步骤。

制各样品供试液所用溶剂普通要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中；但中药制剂往往希望将各成份尽可能多地提取出来，最常被选取是甲醇或乙醇，欲测成份和许多其它"杂质"均可能被提取出来。所以供试液净化就显得更为必要。

样品供试液净化方法通常有1．单一溶剂萃取法；2．分段萃取法；3．液液萃取法；4．固液萃取法。

薄层色谱法医学知识专家讲座第23页②薄层色谱点样技术

点样是薄层色谱第一步，也是关键一步，它既关系到能否得到能够重现薄层色谱，也关系到定量测定结果准确是否，因为不良点样是测定误差最主要起源。

普通在常规薄层板上原点直径小于4mm，高效薄层板要求原点直径小于2mm。点样量不宜过大，最好控制在10μl以下，如在一个位置重复屡次点样时，须注意尽可能不将原点点成一个空心圈。

选取溶剂沸点不宜太高（如正丁醇）或太低（如己醚）。如用乙醚提取，可将最终溶液改用其它非极性溶剂。如用亲水性溶剂，或在较高相对湿度环境下点样，点样后应将薄层板再干燥（如真空干燥）。点样时需注意尽可能不要损伤薄层板表面。

薄层色谱法医学知识专家讲座第24页③吸附剂活性与相对湿度影响

吸附剂活性是由吸附剂如硅胶表面能和表面积决定；硅胶硅醇基是亲水性基团，很易吸附水分子而成为水合硅醇基而失去活性；自制硅胶薄层板在105～110℃加热若干时间，就是使水合硅醇基脱水变为游离硅醇基而活化。反之，活化后薄层板也能够吸附大气中水分子而降低活性。说明硅胶表面吸附水份作用是可逆；在日常操