含P43启动子aiiA基因重组枯草芽孢杆菌的构建与表达

含P43启动子aiiA基因重组枯草芽孢杆菌的构建与表达陈嘉蔚;赵培静;邓锦波;李姣清;明飞平;张淑霞;卢悄佳;张玲华【摘要】细菌群体可以通过响应N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)激活某些致病基因的表达,而芽胞杆菌可以表达AiiA(Autoinducerinactivation)蛋白降解病原菌的AHLs从而减低损害•为构建外源高效表达AiiA蛋白的工程菌利用AiiA蛋白降解AHLs分子来防治细菌性植物病害，通过搭桥PCR扩增P43-aiiA联合片段，连接pHY300PLK载体，构建P43-aiiA-C11枯草芽抱杆菌菌株,验证其AiiA酶活•结果成功克隆得到P43-aiiA片段,经鉴定P43-aiiA-PHY300PLK成功转入C11菌株，通过AiiA活性检测,野生菌株组指示菌全部变蓝,3个平行实验组的蓝色指示菌至条状培养基中间变浅,至下端全部为白色菌落,说明实验所构建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬灭酶活性，能明显降解信号分子•与野生型菌株相比，构建菌株P43-aiiA-C11表达产物具有显著降解AHLs的能力，研究结果为推动植物病害防治提供了重要理论基础.期刊名称】《广东农业科学》年(卷),期】2018(045)011【总页数】7页(P21-27)【关键词】P43启动子;aiiA基因;群体感应;枯草芽抱杆菌【作者】陈嘉蔚;赵培静;邓锦波;李姣清;明飞平;张淑霞;卢悄佳;张玲华【作者单位】华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642;广州市微生物研究所,广东广州510663;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642;广州市微生物研究所,广东广州510663;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642;华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S154.38+1细菌通过称为群体感应(quorumsensing,QS)的机制响应细菌群体密度变化，进而调控目的基因的表达。细菌分泌一种小分子自诱导物(Autoinducer，AI)，该信号物质可以通过自由扩散进入细胞壁和细胞膜，当其浓度随细菌密度增加而提高到一个临界浓度时，细菌群体就能响应信号分子表现出某些生物学功能，以适应环境变化，为种群争取更大的优势［1-2］。N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserinelactones，AHLs)是细菌群体感应系统中的关键信号分子，它在革兰氏阴性细菌群体感应系统中普遍存在，调控多种致病菌毒力因子、胞外多糖和抗生素的表达，促进生物膜形成和孢子产生，强化自身群体与其他细菌、真菌、植物和动物的生存竞争［3］。当AHLs浓度达到阈值，能激活致病基因的表达，诱发细菌性软腐病、青枯病、真菌侵染、灰霉病等疾病，严重危害经济作物［4-6］。几种土壤细菌可以通过酶降解AHLs来干扰QS,该现象被称为群体淬灭［7］。大部分芽胞杆菌可以通过自诱导物失活(Autoinducerinactivation,AiiA)蛋白水解AHLs的内酯环，从而破坏细菌的QS系统，减弱其产生的危害［8］。因此，利用AiiA蛋白降解AHLs分子来防治细菌性植物病害的研究也逐渐展开，目前AHLs的降解已被证明是控制植物细菌性感染的有效方法［9-11］。然而，由于芽抱杆菌表达的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，表达水平较低，也不能分泌到胞外对环境中的AHLs分子进行降解，因此目前国内外对提高AiiA蛋白的表达量及活性研究主要包括两大方向：构建外源高效分泌表达AiiA蛋白的工程菌以及将aiiA基因转化植株，但aiiA基因在转基因植物中的表达对植物生长、发育以及转基因食品对人体的影响尚不清楚，欧阳乐军等成功构建了aiiA基因的植物表达载体pCAM-aiiA，总体而言转aiiA植物的研究相对较少［12-13］。目前，AiiA蛋白已经在原核表达系统和真核表达系统中得到了表达，如大肠杆菌、苏云金芽抱杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统［14-16］。但大肠杆菌异源性表达目的蛋白容易形成包涵体等缺点使其研究及在工农业上的应用受到一定限制。研究发现，不同表达系统的aiiA基因存在密码子偏好性差异，其中芽胞杆菌aiiA基因与毕赤酵母差异较大，如需实现aiiA基因的高效表达必须进行密码子突变或者进行全序列同义合成［17-18］。本研究从枯草芽抱杆菌中扩增胞苷脱氨酶(CDD)基因的启动子P43以及aiiA基因，采用搭桥PCR的方法将P43强启动子连接到aiiA基因上游，构建P43-aiiA-C11重组枯草芽抱杆菌，重组菌株具有良好的降解AHLs能力，对将AiiA蛋白应用于农作物病害防治具有重要意义。1材料与方法试验材料1.1.1菌株与质粒大肠杆菌(E.coli)DH5a、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)NTL4(pZLR4)(含traG-lacZ融合基因和traR基因，羧苄青霉素抗性，庆大霉素抗性)、根癌农杆菌NTL4(pTiC58AaccR,含tral基因)由华南农业大学生命科学学院微生物实验室保存，枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)C11(该菌株是本实验室前期通过大量田间实验分离筛选得到的具有良好预防青枯病致病菌作用的生防菌株)；PMD20-T载体购于大连宝生物公司，pHY300PLK枯草芽抱杆菌-大肠杆菌穿梭载体购于TaKaRa公司。1.1.2工具酶及其他试剂XbaI、EcoRI等限制性内切酶、pfu高保真酶、Taq聚合酶购于TaKaRa公司；羧苄青霉素(Car)、庆大霉素(Gm)等抗生素购自北京鼎国生物技术有限公司。1.1.3引物根据NCBI上已公布的枯草芽抱杆菌P43启动子序列(EF473728.1)以及aiiA基因序列(DQ000640.1)，设计2对引物(Primer1/2、Primer3/4)，引物由上海生工公司合成，引物序列见表1。表1引物序列Primer1启动子上游引物P43-FGCTCTAGATGATAGGTGGTATGTTTTCGXbalPrimer2启动子上游引物P43-RGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGCT无Primer3基因上游引物aiiA-FGAGAGGAATGTACACATGACAGTAAAAAAACTTTA无Primer4基因上游引物aiiA-RCGGAATTCCTATATATACTCTGGGAACGCEcoRI试验方法1.2.1PCR扩增P43启动子与aiiA基因以本实验室从枯草芽抱杆菌总DNA中扩增得到的P43启动子和aiiA基因为模板，以Primer1/2和Primer3/4为引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系：10xpfubuffer2pL,dNTP(2.5mmol/L)1pL,引物Primer1/2或Primer3/4(10pmol/L)各1pL,pfu酶0.5pL,模板1pL,补ddH2O至20pL。PCR反应程序：94°C预变性3min,(94°C变性30s,58C退火40s,72C延伸1min)x30循环,72C延伸10min。1.2.2搭桥PCR连接P43启动子与aiiA基因PCR反应得到的启动子P43扩增片段3'端带有aiiA扩增片段的第1~20个碱基，aiiA基因扩增片段5'端带有P43扩增片段的15个碱基。将PCR反应得到的P43启动子与aiiA基因扩增产物纯化后混合，用Primer1和Primer4进行PCR扩增(具体流程见图1)。PCR反应体系：10xpfubuffer5pL,dNTP(2.5mmol/L)2.5pL,引物Primer1、Primer4(10pmol/L)各2.5pL,pfu酶0.5pL,P43与aiiA扩增回收产物各1pL,补ddH20至50pL。PCR反应程序：94°C预变性3min,(94°C变性30s,58°C退火40s,72°C延伸2min)x30循环，72°C延伸10min。图1搭桥PCR扩增P43-aiiA1.2.3构建P43-aiiA-pHY300PLK重组质粒将PCR扩增得到的P43-aiiA片段纯化回收后与PMD20-T载体连接，转化DH5a后进行菌落PCR与双酶切鉴定并提取质粒送测序，鉴定正确后利用XbaI、EcoRI对P43-aiiA片段和pHY300PLK载体进行双酶切，纯化回收后进行连接，并转化DH5a进行鉴定与测序，重组质粒命名为P43-aiiA-pHY300PLK(具体流程见图2)。鉴定正确后，将重组质粒转化枯草芽抱杆菌C11。图2P43-aiiA-pHY300PLK重组质粒的构建1.2.4验证AiiA酶活性AiiA酶活性检测参照文献［19］的方法并略作改进。用根瘤农杆菌NTL4(pZLR4)作为指示菌检测长酰基链AHLs，该菌株携带含有traR和traG-lacZ融合基因的质粒pZLR4，长酰基链AHLs可诱导traR蛋白的转录，激活traG-lacZ融合基因的表达邛-半乳糖苷酶的活性可用于traG转录的报告［20-21］。根癌农杆菌NTL4(pTiC58AaccR)含有tral基因，其编码tral蛋白可以大量合成AHLs分子［22］。将根癌农杆菌NTL4(pTiC58AaccR)的16h培养液离心，取上清过滤除菌，按2%接菌至过滤上清液，接野生型枯草芽抱杆菌C11作阴性对照，阳性对照用新鲜YEP培养液接待测菌，培养过夜后，离心取上清液作样品。检测方法一：取上清液10pL加至含X-gal的条状YEP琼脂培养基，待上清液基本被培养基吸收后，在样品下方均匀点接指示菌NTL4(pZLR4)，每个0.8pL,28C培养24h后观察并记录试验结果(具体操作见表2)，待测样品点样处与最远的蓝色菌落的距离若小于阴性对照，表明该样品具有AiiA活性。检测方法二：将指示菌NTL4(pZLR4)涂布至含X-gal的YEP平板，取样品上清液10"功。至平板上，28©培养24h后观察试验结果，待测样品点样处蓝色菌落范围若小于阴性对照，表明该样品具有AiiA活性，范围越小则AiiA活性越高。表2验证AiiA活性流程步骤15mLYEP培养液根癌农杆菌NTL4(pTiC58AaccR)+5mLYEP培养液，培养16h,4000r/mm离心5min取上清过滤除菌步骤22%P43-aiiA-C11接种于2mLYEP培养液2%枯草芽孢杆菌C11接种于2mL滤液步骤3培养过夜，离心取上清夜10"功D至含有100Ug/mL羧苄青霉素、30ug/mL庆大霉素、40“g/mLX-gal的条状YEP琼脂培养基步骤4待上清液基本被培养基吸收后，在样品下端逐个点指示菌NTL4(pZLR4)，每个0.8uL,28C培养24h后观察并记录试验结果2%P43-iiA-C11接种于2mL滤液2结果与分析2.1P43启动子与aiiA基因的克隆通过PCR扩增出带酶切位点的P43启动子与aiiA基因片段大小分别应为308bp和776bp,经琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与预期结果相符，但P43启动子扩增产物有非特异条带(图3),对P43启动子与aiiA基因扩增产物进行切胶回收。图3P43启动子与aiiA基因扩增产物电泳结果2.2重组质粒P43-aiiA-pHY300PLK的构建通过SOEPCR扩增得到的P43-aiiA片段应为1069bp,经琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段大小与预期结果相符(图4)。图4P43-aiiA片段扩增产物电泳结果将P43-aiiA片段与pMD20-T载体连接，转化DH5a后进行菌落PCR鉴定并提取质粒送测序，测序结果正确；对P43-aiiA片段和pHY300PLK质粒进行双酶切与连接，并转化DH5a进行鉴定与测序，测序结果正确。将重组质粒转化枯草芽抱杆菌C11,进行菌落PCR与双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，菌落PCR扩增条带大小与双酶切片段大小都与预期结果相符（图5），重组菌株命名为P43-aiiA-C11。图5P43-aiiA-C11菌落PCR与双酶切验证AiiA酶活验证AiiA活性检测结果见图6A，阴性对照中指示菌NTL4（pZLR4）几乎全部变蓝，只有最下端菌落蓝色较浅；3个平行试验的指示菌至条状培养基中间蓝色开始变浅，至下端全部为白色菌落。由图6B可知，平板上试验组蓝色扩散范围（25mm）比阴性对照（15mm）小，而阳性对照中均为白色菌落。说明农杆菌NTL4（pTiC58AaccR）培养液上清中含有AHLs分子，而实验所构建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬灭酶活性，能明显降解信号分子。图6P43-aiiA-C11菌株AiiA酶活验证3结论与讨论本试验成功扩增P43启动子和aiiA基因的联合片段P43-aiiA，构建含有P43启动子和aiiA基因的穿梭载体P43-aiiA-pHY300PLK,并成功导入枯草芽抱杆菌中表达。与野生型菌株相比，构建菌株P43-aiiA-C11表达产物具有显著的降解AHLs能力，为构建防治植物病害的基因工程菌株带来了新方向，对减少农作物致病因素具有重要意义。AiiA蛋白能够降解革兰氏阴性菌产生的信号分子AHLs，从而抑制致病菌的生长以及致病基因的表达，达到生物防治的效果。但天然AiiA蛋白的表达量较低，温真等［23］用aiiA基因的启动子代替pET-28a中的T7启动子，经荧光显微镜镜观察，发现aiiA基因的启动子强度并不是很强，较新的研究表明aiiA启动子中还包含负调控序列［24］。为了提高AiiA蛋白的表达量，吴怀光等［25］利用苏云金芽抱杆菌S-层蛋白基因与杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子与aiiA基因融合表达，得到了能高效和稳定表达AiiA蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株。曾世涌等［26］利用枯草芽抱杆菌eglS基因的启动子与信号肽序列在枯草芽抱杆菌中表达苏云金芽抱杆菌aiiA基因，表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性。陈珺君等［27］利用野生型多黏芽胞杆菌表达苏云金芽胞杆菌aiiA基因，结果表明AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有抗病活性，但不具有抑菌活性。然而，在天然环境下，异源性表达无可避免会遇到密码子偏好性差异的问题，影响目的基因的表达。2007年Pan等［28］首次从枯草芽抱杆菌中克隆得到aiiA基因，因此本研究选用枯草芽抱杆菌C11作为表达菌株表达枯草芽抱杆菌aiiA基因，枯草芽抱杆菌表达系统具有表达量高、生长迅速、适应性强、容易培育的优点，与大肠杆菌表达系统相比，利用枯草芽抱杆菌表达的重组蛋白大多具有生物活性和维持天然结构，枯草芽抱杆菌也是目前应用较广的微生物杀菌剂之一。本研究通过搭桥PCR扩增枯草芽抱杆菌启动子P43以及aiiA基因的联合片段，连接穿梭载体PHY300PLK转化草芽抱杆菌。P43是组成型启动子，研究发现P43启动子在枯草杆菌生长对数前期已开始表现活性，随后转录活性迅速提高，有利于AiiA蛋白在天然环境下持续性表达［29-30］。Wan等［31］通过启动子替换构建pMA0911-P43-PUL，在同等条件下测定支链淀粉酶最高酶活可提高2倍。本研究利用指示菌NTL4(pZLR4)在AHLs存在的条件下能在含有X-gal平板上长出蓝色菌落的原理，通过在条状培养基上点接指示菌和在平板上涂布指示菌，均验证P43-aiiA-C11菌株对AHLs信号分子具有明显淬灭活性。而AiiA蛋白不含信号肽［32］,研究工作将进一步提高AiiA蛋白的分泌表达，增强其在土壤环境中降解AHLs分子的效力。参考文献：相关文献】GaoM,ChenH,EberhardA,etal.EffectsofAiiA-mediatedquorumquenchinginSinorhizobiummelilotionquorum-sensingsignals,proteomepatterns,andsymbioticinteractions[J].Molecularplant-microbeInteractions,2007,20(7):843-856.RajeshPS,RaiVR.UseofaiiAgeneamplificationforAHL-lactonaseproductionfromendophyticbacteriumEnterobacterspecies[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2015,72:1013-1019.UlrichRL.Quorumquenching:EnzymaticdisruptionofN-acylhomoserinelactone-mediatedbacterialcommunicationinBurkholderiathailandensis[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2004,70(10):6173-6180.WuZH,XieYJ,LuoLF,etal.AdvancesinresearchonbacterialwiltcausedbyRalstoniasolanacearuminEucalyptusspp.inChina[J].ForestResearch,2007,20:569575.MahmoudiE,NaderiD,VittorioV,etal.AiiAlactonasedisruptsN-acylhomoserinelactoneandattenuatesquorum-sensing-relatedvirulenceinPectobacteriumcarotovorumEMPCC[J].AnnalsofMicrobiology,2013,63(2):691-697.OuyangLJ,LiLM.EffectsofaninducibleaiiAgeneondiseaseresistanceinEucalyptusurophyllaxEucalyptusgrandis[J].TransgenicResearch,2016,25(4):441-452.ParkSJ,ParkSY,RyuCM,etal.TheroleofAiiA,aquorum-quenchingenzymefromBacillusthuringiensis,ontherhizospherecompetence[J].JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2008,18(9):1518-1521.KhoiriS,TriAD,GiyantoG.Identificationofquorumquenchingbacteriaanditsbiocontrolpotentialagainstsoftrotdiseasebacteria,dickeyadadantii[J].Agrivita,2017,39(1):45-55.DongYH,ZhangLH.Quorumsensingandquorum-quenchingenzymes[J].JournalofMicrobiology,2005,43(1):101-109.BaiF,HanY,ChenJ,etal.DisruptionofquorumsensinginVibrioharveyi,bytheAiiAproteinofBacillusthuringiensis[J].Aquaculture,2008,274(1):36-40.韩丽伟，屈淑平，崔崇士.aiiA基因在植物软腐病研究中的应用进展[J]•中国蔬菜，2011(8)：1-6.ZhangL,RuanL,HuC,etal.FusionofthegenesforAHL-lactonaseandS-layerproteininBacillusthuringiensisincreasesitsabilitytoinhibitsoftrotcausedbyErwiniacarotovora[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2007,74(3):667-675.[13]欧阳乐军，沙月娥，郭耀权，等•苏云金芽抱杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建[J]•广东农业科学,2011,38(21):135-137.[14]娄瑞娟，张霞，罗利龙，等.aiiA基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达[J].微生物学通报，2010，37（5）：658-663.ChenR,ZhouZ,CaoY,etal.HighyieldexpressionofanAHL-lactonasefromBacillussp.B546inPichiapastorisanditsapplicationtoreduceAeromonashydrophilamortalityinaquaculture[J].MicrobialCellFactories,2010,9（1）:39-54.WuJ,JiaoZ,GuoF,etal.ConstitutiveandsecretoryexpressionoftheAiiAinPichiapastorisinhibitsAmorphophalluskonjacsoftrotdisease[J].AmericanJournalofMolecularBiology,2016,6（2）:79-87.[17]曾世涌，苏小惠，谢盼盼，等.苏云金芽胞杆菌中aiiA基因密码子偏好性分析[J].生物技术进展，2013（4）：257-263.[18]简思美，蔡斌斌，吴程，等.基因改造AiiA蛋白在毕赤酵母中的表达[J].福建师范大学学报（自然科学版），2015，31（6）：55-63.DongYH,XuJL,LiXZ,etal.AiiA,anenzymethatinactivatestheacylhomoserinelactonequorum-sensingsignalandattenuatesthevirulenceofErwiniacarotovora[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2000,97（7）:3526-3531.储卫华，刘永旺，朱卫.群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立[J].生物技术通报，2011（3）：166-169.NievasF,BoginoP,SorrocheF,etal.Detection,characterization,andbiologicaleffectofquorumsensingsignalingmoleculesinpeanut-nodulatingBradyrhizobia[J].Sensors,2012,12（3）:2851-2873.SuleS,CursinoL,ZhengD,etal.SurfacemotilityandassociatedsurfactantproductioninAgrobacteriumvitis[J].Letters