酶的蛋白质工程

酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程第1页蛋白质工程蛋白质工程：是以蛋白质空间结构及其与生物学功效关系为基础，经过分子设计和由设计结果所指导特定基因修饰，而实现对天然蛋白质定向改造。目标：是为结构并生产性能比现有蛋白质愈加符合人类需要蛋白质新品种提供科学依据和技术路径，同时，为分子生物学基础理论研究提供强有力新伎俩。酶的蛋白质工程第2页蛋白质结构

1952年丹麦生物化学家Linderstrom-Lang首次提出蛋白质三级结构概念：一级结构：指多肽链中氨基酸一定次序，靠共价键维持多肽链连接，而不包括其空间排列。二级结构：指多肽链骨架局部空间结构，不考虑侧链构象及整个肽链空间排列。三级结构：指整个肽链折叠情况，包含侧链排列，也就是蛋白质分子空间结构或三维结构。1958年英国晶体学家Bernal提出四级结构概念：四级结构：指蛋白质亚基排列。酶的蛋白质工程第3页蛋白质超二级结构和结构域超二级结构：1973年Rossman提出，指二级结构组合物。结构域：由Porter提出，是指蛋白质分子中那些显著分开球状个别。酶的蛋白质工程第4页

蛋白质工程就是对自然界存在蛋白质加以改造，改造目标是得到性能更符合人类要求非天然蛋白质，以用于工业、农业、医药卫生等各领域。酶的蛋白质工程第5页蛋白质改造方法：经过改造它们基因，再用基因工程方法由工程菌种来生产新蛋白质。与药品设计关系：多年来伴随药品设计发展需要，基于生物大分子结构知识药品设计已成为药品发展中主要领域，因为这种设计路径在很大程度上与蛋白质工程有着深刻和广泛联络，所以往往在学术上与蛋白质工程一起讨论。酶的蛋白质工程第6页三类教授：①蛋白质空间结构测定教授；②蛋白质分子设计教授；③基因工程教授。酶的蛋白质工程第7页空间结构测定教授：主要应用X射线晶体结构分析方法与技术对蛋白质分子空间结构进行试验测定。酶的蛋白质工程第8页分子设计教授：在了解了需要改造蛋白质性能及其对应结构基础之后，主要经过理论方法，提出蛋白质改性设计方案，这一方案将提供改性后蛋白质哪些个别氨基酸次序与天然蛋白质不一样，这些新序列能够造成怎样空间结构和电子结构改变，从而能赋予新蛋白质什么样特征。

酶的蛋白质工程第9页当前分子设计主要以能显示图形图象计算机为工具，采取基于物理学原理各种模拟方法和基于蛋白质改性分子结构知识模型构建方法，或兼用这两类方法。酶的蛋白质工程第10页基因工程教授：在得到了新蛋白质改性设计方案之后，就用一套分子生物学技术，先合成对应基因模板，再经过克隆与表示，得到新蛋白质产物，最终经过分离、纯化，提取出足够纯新蛋白质以研究它性质。酶的蛋白质工程第11页蛋白质工程这一程序不是一次就能实现，往往要经过屡次循环，不停改进设计方案才能发觉一个理想新改性蛋白。酶的蛋白质工程第12页当前蛋白质工程研究热点：首先是对含有显著生物学功效天然蛋白质分子；另首先是基于生物大分子结构知识药品设计。酶的蛋白质工程第13页蛋白质人为进化

定向进化随机突变酶的蛋白质工程第14页

生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命延续性，都是因为生物体内一系列酶在发挥着作用。酶确保了生物体内组成生命活动大量生化反应得以按照预定方向有序、准确而顺利地进行，几乎全部生物生理现象都与酶作用紧密相关，能够这么说，没有酶存在，就没有生物体一切生命活动。

天然酶作用酶的蛋白质工程第15页

利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已成为生产精细化学品、手性药品、食品添加剂等主要工具,取得了广泛应用。酶的蛋白质工程第16页

伴随酶催化应用范围不停扩充和研究逐步深入，研究者发觉，酶催化准确性和有效性经常不能很好地满足酶学研究和工业化应用要求，而且天然酶稳定性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值催化功效天然酶局限

天然酶不足源于酶自然进化过程。酶的蛋白质工程第17页当代生物工程对酶要求

提升Vmax，降低Km,改变最适pH能具备长久稳定性和活性能适合用于水及非水相环境能接收不一样底物甚至是自然界不存在合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药品或药品原材料酶的蛋白质工程第18页

怎样利用相对简单方法以到达对天然酶改造或构建新非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景。酶的蛋白质工程第19页

1993年,美国科学家ArnoldFH（加州理工大学，生物化学家）首先提出酶分子定向进化概念，并用于天然酶改造或构建新非天然酶。蛋白质定向进化概念提出酶的蛋白质工程第20页

人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在亲本酶（天然或者人为取得）出发，经过基因突变和重组，构建一个人工突变酶库，经过一定筛选或选择方法最终取得预先期望含有一些特征进化酶。定向进化技术酶的蛋白质工程第21页定向进化原理酶的蛋白质工程第22页定向进化＝随机突变＋选择酶的蛋白质工程第23页随机突变策略易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一个有效新方法交织延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一个简化DNAshuffling技术酶的蛋白质工程第24页易错PCR易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目标基因同时引入碱基错配，造成目标基因随机突变。连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到有用突变基因作为下一次PCR扩增模板，连续重复地进行随机诱变。酶的蛋白质工程第25页易错PCR：是一个简单、快速、廉价随机突变方法。原理：经过改变PCR条件，通常降低一个dNTP量（降至5%-10%）使PCR易于犯错，到达随机突变目标。还能够加入dITP来代替被降低dNTP，又会使下一轮循环中出现更多错误。在PCR缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提升突变率。酶的蛋白质工程第26页DNA改组DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR(sexualPCR)，即将DNA拆散后重排。它是模仿自然进化一个DNA体外随机突变方法。这种方法不但能够对一个基因人为进化，而且能够将含有结构同源性几个基因进行重组，共同进化出一个新蛋白质。酶的蛋白质工程第27页1.目标基因片段准备：依据不一样需要选择一个基因或其片段，也能够是几个序列上含有较高同源性基因；2.DNaseI酶切：将基因随机切割成约10-50bp或300bp左右小片段；3.不加引物PCR：在Taq酶作用下将切割后DNA重合小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组；4.加引物PCR：加入目标基因片段两端引物，使连接好DNA得到扩增，筛选正突变,得到正突变子又能够重复进行DNAshuffling。DNAshuffling基础过程包含四个步骤：酶的蛋白质工程第28页体外随机引发重组

体外随机引发重组(randompriminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不一样位点短DNA片段，因为碱基错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少许点突变，在随即PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整基因长度。酶的蛋白质工程第29页交织延伸交织延伸(staggerextensionprocess,StEP)PCR是在PCR反应中把常规退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间，从而只能合成出非常短新生链，经变性新生链再作为引物与体系内同时存在不一样模板退火而继续延伸。此过程重复进行，直到产生完整基因长度。酶的蛋白质工程第30页定向进化筛选策略琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，经过宿主菌生长情况、培养基颜色、特定反应出现等判断是否含有目标基因。微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取含有活性克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法细胞经荧光染色后，经过高速流动系统，排成单行，逐一经过流式细胞计数仪进行测定。突变体分离酶的蛋白质工程第31页经过酶促反应特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标识底物经过检测底物消耗或产物生成进行终点检测酶检测信号探测分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁酶的蛋白质工程第32页定向进化与自然进化异同点定向进化实质是达尔文进化论在分子水平上延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择自然进化，使进化朝着大家需要方向发展。二者不一样：进化动力不一样：保守突变非保守取代；进化方向不一样：适应突变积累；进化速度不一样：非常漫长只需几年、甚至几天；

进化目标不一样：适应环境超越生物学意义要求，探索所希望蛋白质在次序空间可及性。酶的蛋白质工程第33页定向进化技术酶的蛋白质工程第34页目标酶所需功效方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime抗性增加3倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交织延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍特异性增加1000倍大肠杆菌定向进化应用酶的蛋白质工程第35页蛋白质工程改造实际应用枯草芽孢杆菌蛋白酶：一个丝氨酸蛋白酶，是工业上应用很广酶，在洗涤剂、制革、丝绸等各种行业上有广泛用途。分子量较小，27.5kDa，功效研究比较清楚，产生菌基因也已经被克隆，并已建立适当表达载体系统，是蛋白质工程理想研究对象。酶的蛋白质工程第36页酶的蛋白质工程第37页酶的蛋白质工程第38页酶的蛋白质工程第39页酶的蛋白质工程第40页(succinyl)-Ala-Ala-Pro-X-