MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件

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主办：湖南省生物医学信息专业委员会湖南省赢通基因与细胞工程技术研究中心

生物医药科研网承接：赢润生物重庆迈凯科技有限企业能润医学MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第2页MicroRNA研究策略赢润生物年12月MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第3页讲座根本MicroRNA介绍MicroRNA检测MicroRNA过表示怎样下调MicroRNAMicroRNA靶基因验证试验MicroRNA相关SCI论文实例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第4页一.MicroRNA介绍MicroRNA（miRNA）是一类内生、长度约20-24个核苷酸小RNA。其在细胞内含有各种主要调整作用。网状作用模式：每个miRNA能够有多个靶基因，而几个miRNAs也能够调整同一个基因。据推测，miRNA调整着人类三分之一基因。miRNA数据库：MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第5页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第6页两个概念：pri-miRNApre-miRNAMaturemiRNAmiRNA种子序列（seedsequence）：成熟miRNA5’端第2～8位核苷酸与靶mRNA3’端非翻译区（UTR）部分序列结合很主要，被称为种子序列。MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第7页二.MicroRNA检测MicroRNA芯片优点：高通量缺点：成本高；难区分前体miRNA和成熟miRNANorthernblot优点：能比较直观反应miRNA表示量高低缺点：步骤复杂；难区分前体miRNA和成熟miRNAMicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第8页miRNAqPCR检测（Real-timePCR）优点：可区分前体miRNA和成熟miRNA；检测灵敏度高；高特异性；成本较低难点：MaturemiRNA很短，怎样检测？处理方法：加长序列MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第9页miRNAqPCR检测：Stem-loop法MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第10页miRNAqPCR检测：PolyA加尾法MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第11页Stem-loop法优点：特异性高缺点：每做一次RT，只能检测一个miRNA代表厂家：ABI、AmbionPolyA加尾法优点：通用性高；一次RT能够检测多个miRNA缺点：特异性稍差代表厂家：QiagenMicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第12页三.MicroRNA过表示pri-miRNApre-miRNAMaturemiRNA载体形式载体形式化学合成：mimicsCMV开启子~600bp转染效率高可长久表示可带荧光U6/H1开启子70~600bp可带荧光可长久表示转染效率高miRNA成熟序列价格较高价格较高可进行各种修饰可带荧光作用时间短转染效率有时较低价格较低MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第13页pri-miRNA结构：CMVp---EGFP---pri-miRNA---PolyApre-miRNA结构：hU6p---pre-miRNA---TTTTTT人工pri-miRNA结构：CMVp---EGFP---mir30左臂---pre-miRNA---mir30右臂---PolyAMicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第14页pYr-pri-miRNA构建用载体MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第15页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第16页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第17页pYr-pri-miRNA构建用载体MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第18页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第19页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第20页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第21页pYr-pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第22页人工pri-miRNA范例MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第23页Tips：pri-miRNA过表示，miRNA能够提升多少？（1）假如目标细胞中已经有miRNA高表示：大约提升2~5倍。（2）假如目标细胞中目标miRNA低表示或无表示：大约能提升50~1000倍。MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第24页四.怎样下调MicroRNA怎样下调miRNA，实现loss-of-function研究？（1）化学合成miRNAantisensoligo。优点：比较经济；合成时间较短缺点：作用时间短；转染效率受限制MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第25页（2）载体形式miRNAinhibitor。优点：可长久稳定作用；转染效率高缺点：构建周期较长MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第26页怎样构建载体形式miRNAinhibitor方法一：miRNAspongeMicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第27页miRNAsponge作用效果MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第28页怎样构建载体形式miRNAinhibitor方法二：miRNADecoy（TuDRNAs）MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第29页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第30页miRNADecoy作用效果MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第31页五.MicroRNA靶基因验证试验promoter汇报基因miRNA靶序列CMVpSV40pTKpRlucFlucEGFP全段3’UTR部分3’UTRβ-galMicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第32页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第33页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第34页检测方法（1）miRNA靶标载体、内参荧光素酶载体、miRNAmimics或miRNA过表示载体共转染。（2）带有内参荧光素酶miRNA靶标载体、miRNAmimics或miRNA过表示载体共转染。然后做双荧光素酶检测试验。MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第35页深入确定目标miRNA和靶基因之间关系（1）构建含突变靶位点miRNA靶标载体。其它步骤同前。（2）靶基因表示检测：目标miRNA上调或下调过程中，靶基因表示量改变情况。MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第36页机制研究目标miRNA靶基因细胞表型下游基因MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第37页六.MicroRNA相关SCI论文实例SCI论文实例一影响因子：2.8MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第38页第一步：经过预测软件选取待选miRNA（58个）MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第39页第二步：构建待选miRNA过表示载体MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第40页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第41页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第42页第三步：双荧光素酶检测试验MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第43页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第44页第四步：miRNA对目标基因表示量影响MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第45页第五步：深入验证miR-503与CCND1关系MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第46页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第47页细胞表型水平验证：MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第48页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第49页SCI论文实例二影响因子：8.15MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第50页第一步：发觉组织和细胞中miR-205表示差异MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第51页第二步：过表示miR-205，发觉细胞增殖受到抑制MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第52页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第53页miR-205表示上调后，肿瘤细胞侵袭能力下降MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第54页第三步：选择靶基因，双荧光素酶检测试验MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第55页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第56页第四步：miR-205上调对靶基因表示量影响MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第57页SCI论文实例三影响因子：~28MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第58页第一步：针对目标基因，选择待选miRNA（软件）MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第59页最终选定miR-101作为研究对象MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第60页第二步：深入试验验证miR-101和EZH2之间关系（1）双荧光素酶检测（2）过表示miR-101及其它几个miRNA，检测EZH2表示MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第61页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第62页Western-blot检测MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第63页第三步：研究miR-101、EZH2、细胞表型之间关系细胞增殖：MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第64页肿瘤细胞侵袭能力MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第65页成瘤试验MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第66页第四步：机制研究MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第67页MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第68页第五步：结论MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第69页MicroRNA研究思绪之一MicroRNA芯片检测miRNAqPCR检测Northern检测确定欲研究miRNA选择作用靶基因靶基因验证试验基因表示检测细胞表型检测miRNA上调或下调组织或细胞MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件第70页MicroRNA研究思绪之二确定目标基因miRNAqPCR检测Northern检测确定欲研究miRNA确定若干个目标miRNAmicroRNA芯片检测miRNA上调或下调靶基因验证试验基因表示检测细胞表型检测MicroRNA转化医学研究及SCI论文策略课件