病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训专家讲座

弧菌和弯曲菌医学检验系临床微生物及免疫学教研室

井申荣病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第1页第一部分弧菌病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第2页概述弧菌科（Vibrionaseae）包含一群氧化酶阳性、含有端极鞭毛、动力阳性细菌，有4个菌属，其中，弧菌属是一群氧化酶阳性，发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感细菌。弧菌属(Vibrio)广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100各种。主要致病菌为霍乱弧菌和副溶血弧菌（致病性嗜盐菌）。前者引发霍乱；后者引发食物中毒。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第3页霍乱弧菌

霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱病原体，霍乱是一个古老且流行广泛烈性传染病之一。曾在世界上引发屡次大流行，主要表现为猛烈呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。属于国际检疫烈性传染病。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第4页霍乱弧菌包含两个生物型：古典生物型（Classicalbiotype）和埃尔托生物型（EL-Torbio-type）。这两种型别除个别生物学性状稍有不一样外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质差异。自18以来，全球共发生了七次世界性大流行，前六次病原是古经典霍乱弧菌，第七次病原是埃尔托型所致。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第5页

1992年10月在印度东南部又发觉了一个引发霍乱流行新血清型菌株（0139），它引发霍乱在临床表现及传输方式上与古经典霍乱完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊疗血清所凝集。该菌株在水中存活时间较01群霍乱弧菌长，因而有可能成为引发世界性霍乱流行新菌株。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第6页一、生物学性状

（一）形态染色霍乱弧菌呈弧形或逗点形态，大小为1.4~2.6×0.5~0.8μm。革兰氏阴性菌，菌体一端有单根鞭毛和菌毛，无荚膜与芽胞。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为活泼，呈流星穿梭运动。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第7页图注：霍乱弧菌鞭毛（↑）和它可溶解鞘膜（↑↑）负染，×3100

图注：分裂中霍乱弧菌冰冻蚀刻，×70000

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第8页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第9页（二）培养特征霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌;营养要求不高，耐碱不耐酸，在pH8.8～9.0碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其它细菌在这一pH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌培养基;在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第10页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第11页惯用选择培养基为硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS），霍乱弧菌在其中可形成较大菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第12页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第13页（三）生化反应两个生物型霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明胶酶试验均阳性。能产生靛基质，霍乱红反应阳性病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第14页ElTor型霍乱弧菌与古经典霍乱弧菌生化反应有所不一样ElTor型V－P试验为阳性，能产生强烈溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长菌落周围出现显著透明溶血环，古经典试验V－P试验为阴性，不溶解羊红细胞。个别ELTor型霍乱弧菌株亦不溶血。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第15页霍乱弧菌抗原结构特征O抗原H抗原属共同抗原

＋群特异性＋－型特异性＋－耐热性（100℃2h）＋－（四）抗原性

1．抗原结构：病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第16页2．分群和分型：依据O抗原特异性，可将霍乱弧菌分成139个血清群。依据是否与O1抗血清凝集分两大群，凡能与O1群抗血清发生凝集称为O1群霍乱弧菌；凡不被O1群抗血清凝集其它血清群统称为非O1群霍乱弧菌。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第17页O1群霍乱弧菌血清分型型别别名O抗原成份原型稻叶型（Inaba）A、C异型小川型（Ogawa）A、B中间型彦岛型（Hikojima）A、B、C血清型：O1群霍乱弧菌菌体抗原由A、B、C三个抗原成份组成病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第18页生物型：O1群霍乱弧菌有古典生物型和E1Tor生物型之分，两个生物型含有相同血清型。我国流行以ElTor、小川型霍乱弧菌为主。噬菌体分型：对噬菌体敏感性进行分型，其中较为实用是第Ⅳ组和第Ⅴ组噬菌体。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第19页霍乱弧菌两个生物型判别性状古典型E1Tor型溶血（1%绵羊红细胞）－d血凝（2.5%鸡红细胞）－＋V-P试验－＋多粘菌素B敏感试验（50U/片）＋－噬菌体Ⅳ组裂解（106/ml）＋－噬菌体Ⅴ组裂解（106/ml）－＋＋９０％以上为阳性；－９０％以上为阴性；ｄ１０－８９％阳性病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第20页霍乱弧菌变异性形态变异弧型→直杆状→

多形

菌落变异S←→R←→L溶血性变异（ElTor型）溶血性←→非溶血性

传代

毒力变异强毒株←→

弱毒株←→无毒株

血清型别变异小川型←→

稻叶型

（五）变异性：病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第21页（六）抵抗力霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱，EL-Tor生物型抵抗力较强。霍乱弧菌对热、干燥、日光、化学消毒剂和酸均很敏感，耐低温，耐碱而不耐酸。霍乱弧菌对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但ElTor生物型对一定浓度多粘菌素B及庆大霉素有耐药性。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第22页二、致病性和免疫性

1．致病物质（1）鞭毛、菌毛、粘液素酶（2）霍乱肠毒素（choleraenterotoxin）霍乱肠毒素本质是蛋白质，不耐热。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，含有很强抗原性。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第23页霍乱肠毒素1个A亚单位毒性单位A1肽链含有激活腺苷酸环化酶酶活性A2肽链结合B亚单位；参加转位5个B亚单位（4～6）结合单位特异地识别肠上皮细胞膜上神经节苷脂受体病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第24页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第25页致病机理霍乱弧菌胃对酸敏感，很快被杀死肠胃酸降低或缺乏，菌体增多鞭毛、菌毛、粘液素酶绒毛上大量繁殖CTB亚单位结合神经节苷脂受体形成膜通道A1肽链进入细胞病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第26页ATP→

cAMP↑

肠粘膜上皮细胞分泌亢进肠液大量分泌大量体液和电解质进入肠腔而发生猛烈吐泻大量脱水和失盐发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸环化酶系统病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第27页2．所致疾病引发烈性肠道传染病霍乱，为我国法定传染病（甲类），表现为猛烈上吐下泻，造成严重脱水、酸中毒、痉挛、尿闭、休克和死亡。人类在自然情况下是霍乱弧菌唯一易感者，主要经过污染水源或饮食物经口传染（粪口路径）。患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”，并含大量弧菌，此为本病经典特征。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第28页3．免疫性患过霍乱人可取得牢靠免疫力，再感染者少见。病后小肠内可出现分泌型lgA。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第29页三、微生物学诊疗因为霍乱流行快速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，所以早期快速和正确诊疗，对治疗和预防本病蔓延有重大意义。（一）标本采集：

标本以粪便为主，普通米泔水样便采取1－3ml，成形便采取蚕豆大小。在一些情况下，亦可采取呕吐物和尸体肠内容物作检材。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第30页检验程序病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第31页（三）检验方法及判定

1．直接镜检：1）动力观察：采取病人“米泔水样”大便或呕吐物制成悬滴片，观察细菌动力，可见流星或穿梭状动力细菌。2）制动试验：标本，霍乱多价诊疗血清（效价1：64），用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多弧菌才检出。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第32页3）涂片染色：

革兰氏染色阴性并成鱼群状排列弧菌。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第33页2．快速诊疗：1）免疫荧光菌球法：将标本接种于含有霍乱弧菌荧光抗体碱性蛋白胨水中，经37℃4～6h，如有霍乱弧菌，在荧光显微镜下可见发荧光菌球。本法适合用于做大量标本初筛。2）

SPA协同凝集试验：以霍乱弧菌IgG型抗体与SPA阳性葡萄球菌结合作为试剂，与米泔水样便或增菌液作玻片凝集，马上出现显著凝集者（＋＋＋）为阳性。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第34页3．细菌分离培养

1）

直接分离培养：分离用培养基有强、弱2种选择培养基。弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂。强选择培养基：惯用有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等。现多采取碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第35页4．判定：依据霍乱弧菌在各种选择培养基上特点，挑选可疑菌落进行判定。判定以血清学（玻片凝集）为主，结合形态学、生化反应作出判断。1）玻片凝集试验：从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价诊疗血清作玻片凝集试验。诊疗血清应稀释成1:32-1:64效价使用，马上出现凝集者为阳性，同时设生理盐水和阳性细菌株对照。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第36页2）形态学检验：取纯培养物涂片革兰氏染色，观察菌体形态及染色性。用悬滴法或半固体穿刺法检测动力。3）生化反应：霍乱弧菌氧化酶试验、靛基质试验、粘丝试验和霍乱红试验均阳性。

①粘丝试验：用于测定霍乱弧菌形成粘丝特征。将0.5％去氧胆酸钠水溶液于霍乱弧菌混匀制成浓厚菌液，1min内悬液由混变清，并变得粘稠，以接种环挑取时能够拉出丝来。霍乱弧菌古典生物型和ElTor生物型均呈阳性。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第37页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第38页②霍乱红试验：出现蔷薇色，为霍乱红试验阳性。因为霍乱弧菌和其它弧菌都有此种反应，故无特异性。（霍乱弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，霍乱弧菌液能还原硝酸盐为亚硝酸盐，所以当霍乱弧菌培养在含有硝酸盐成份蛋白胨水中，所产生亚硝酸盐可与吲哚结合成亚硝酸吲哚，滴加浓硫酸即可出现蔷薇色，称为霍乱红试验阳性）③O/129敏感试验：将O/129（2，4二氨基－6，7－二异丙基喋啶）药敏纸片（10－150μg）贴在接种有待测菌琼脂平板上作纸片扩散试验，凡药品纸片周围出现抑菌环者为敏感。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第39页4）霍乱弧菌分型判别试验：①血清分型：用小川型和稻叶型单价诊疗血清作玻片凝集。与小川型血清凝集而与稻叶型血清不凝集者为小川型，反之为稻叶型。在两个单价血清中都有显著凝集者为彦岛型。②生物型别判定：当前，两型主要依靠第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验进行判别，并辅以多粘菌素敏感试验、鸡红细胞凝集试验、V－P试验和溶血试验。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第40页⒈第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验：

第Ⅳ组霍乱噬菌体常规稀释液（106/ml）普通仅裂解古经典，而不裂解ElTor型。⒉多粘菌素B敏感试验：

取被检菌2-3h肉汤培养物点种到含药营养琼脂平板上（多粘菌素B50U／ml）,37℃培养24h，ElTor生物型生长，而古经典敏感。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第41页病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第42页⒊鸡红细胞凝集试验：在玻片上滴加生理盐水一滴，取被检菌18-24h培养物少许在盐水中制成浓厚菌悬液，然后加一滴2.5％鸡红细胞悬液，充分混匀，1min内出现凝集者为阳性，红细胞呈均匀分散者为阴性。ElTor生物型为阳性，古经典为阴性。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第43页判定关键点：确诊O1群霍乱弧菌必须具备条件：1、涂片为革兰氏阴性弧菌或杆菌；2、TCBS等选择培养基上经典菌落特征；3、动力阳性；4、O1群霍乱弧菌诊疗血清凝集试验阳性。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第44页四、防治标准必须落实预防为主。人群菌苗预防接种，可获良好效果，治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药品如四环素、链霉素、氯霉素、强力霉素及氟哌酸类抗生素药品。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第45页第二部分弯曲菌属病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第46页弯曲菌属(Campylobacter)细菌是一类微需氧、不分解糖类、氧化酶阳性、菌体弯曲呈逗点状、S型或螺旋状、有动力革兰氏阴性菌。对人类致病主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种，前者是人类腹泻最常见病原菌之一，后者在免疫功效低下时可引发败血症、脑膜炎等。本节主要以空肠弯曲菌介绍本属生物学特征和检验方法病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第47页一、生物学性状（一）形态与染色空肠弯曲菌（C.jejuni）菌体轻度弯曲似逗点状，长1.5～5μm，宽0.2～0.8μm。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。革兰氏阴性。图注：空肠弯曲菌两端单鞭毛（↑）负染，×21000病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第48页（二）培养特征为微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2环境中生长最好。最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。本菌营养要求高，需加入血液、血清才能生长。在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周围不规则，无溶血现象。病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第49页（三）生化反应空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，不液化明胶，靛基质阴性。可还原硝酸盐，氧化酶和过氧化氢酶为阳性。甲基红和VP试验阴性；枸椽酸盐培养基中不生长。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第50页（四）抵抗力抵抗力不强，易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，56℃5分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年发觉了不少耐药菌株。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第51页（五）抗原结构本菌抗原结构与肠道杆菌一样含有O、H和K抗原。依据O抗原，可把空肠弯曲菌分成45个以上血清型。

病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第52页二、致病性与免疫性空肠弯曲菌是各种动物如牛、羊、狗及禽类正常借居菌。污染食物和饮水，可引发人类急性肠炎和食物中毒，其致病原因与肠毒素、内毒素、细胞毒素、侵袭力相关。感染后能产生特异性血清抗体，病原性真菌检验临床微生物学专业知识培训第53页三、微生物学诊疗（一）标本采集：取腹泻病人新鲜粪便或肛拭子马上送检。如不能及时送检，应将标本接种于卡－布运输培养基。（二）检验程序：病原性真菌