食品检验学-张虹ppt课件 4维生素分析测定方

维生素分析测定方法概述维生素是人和动物维持正常的生理功能必需的一类微量有机物质，

根据其溶解性分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。

不同的维生素对人体具有不同的生理作用，缺乏任何一种维生素都会导致相应的缺乏病症，严重不足时可以致命。随着食品工业的发展和人们对营养保健食品需求程度的日渐提高，市场上出现了添加维生素的婴儿配方食品，谷物产品和果汁等维生素强化食品。对于食品中添加的维生素，尤其婴幼儿食品和孕妇及乳母食品必须通过检测，严格控制维生素的添加量。因此，维生素的定量分析在食品营养分析中占有重要地位。针对不同形式维生素的检测，一些传统的分析检测方法已不能满足现代检测的要求，

依据目前我国国家标准，维生素分析方法有微生物法，荧光分光光度法和高效液相色谱法。方法比较单一，与实际需求有一定差距。

随着分析化学新方法和新技术的不断发展，分析维生素的方法也不断更新。本章将对维生素的方法进行总结，并重点介绍两种对维生素同时检测的分析方法。参见

张太昌，孟萌，宋佩，田溪，薛虎寅，张，昱，尹永梅，郗日沫.食物中维生素分析方法的研究进展.生物技术进展.2012,vol.2(2):116-123传统的维生素分析方法

1.微生物分析法微生物分析法根据某种维生素是某种细菌生长所必需的原理,利用比浊法或酸度滴定法测定细菌繁殖程度或代谢产物,间接对该维生素进行定量测定。

该方法以其经典性、准确性以及广泛适用性，成为许多国际机构作为部分维生素分析的标准方法或第一方法。也是我国国家标准GB5413-2010规定的测定婴幼儿食品和乳品中烟酸、烟酰胺、泛酸、生物素、叶酸和VB12的方法.微生物分析法灵敏度高、结果准确,但存在着操作复杂、检测周期长等局限性.2.荧光法荧光法是利用维生素本身具有的荧光性，或经过反应后产生荧光物质，在激发波长和发射波长条件下对维生素定量分析的方法。

荧光分析法因其具有灵敏度高、线性关系好、杂质干扰小等优点而成为近年来检测维生素的标准方法之一。

但其稳定性和选择性方面在某些样品检测中仍然有待提高。3.分光光度法分光光度法测定维生素是根据化合物分子因电子跃迁产生的光谱而进行定性定量分析，是一种简便、快速、成本相对较低的分析方法，因此广泛应用于各种维生素的检测。常用方法有紫外分光光度法，可测定VB1，VB6，VB12，VC,VE分光光度法易受干扰，灵敏度有待提高。现代分析方法

1.化学发光分析化学发光分析法是根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中响应组分的含量，具有灵敏、快速、仪器设备简单等优点。化学发光体系主要包括鲁米诺体系、四价铈体系、钌联吡啶配合物体系、过氧化草酸酯体系、高锰酸钾体系及光泽精体系等。两类：（1）食品添加物直接参与化学发光反应，与化学发光试剂发生氧化还原反应，产生化学发光。（2）分析目标对于已有化学发光体系的增敏或抑制作用。2.电化学分析3.毛细管电泳毛细管电泳法是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，在电场力作用下基于样品离子带电荷不同而造成迁移率不同来进行分离的技术，具有分离速度快、灵敏度高、成本低、样品用量、少等优点。缺点在于样品的微量制备、电渗的控制、重复性差、定性定量困难。另外，毛细管电泳填充物的效果对分析结果有很大的影响。4.超临界流体色（SupercriticalFluidChromatography，SFC)超临界流体色谱是以超临界流体为流动相,依靠流动相的溶剂化能力来进行分离,分析的色谱过程,既可分析气相色谱不适应的高沸点，低挥发性样品，又比高效液相色谱有更快的分析速度和条件。优点：分离速度快‘样品处理方便、选择性高等特点，而且可以兼容多种检测器，实现联机在线色谱联用技术。5.高效液相色谱法高效液相色谱法利用不同物质在流动相和固定相中的选择性分配实现对目标物的分离，

采用液相色谱测定维生素含量。样品的前处理是保证测定结果准确的关键步骤，

样品处理方法有经典的液液萃取、固相萃取、超临界流体萃取和基质固相分散等。具有测定范围广、分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、分析速度快、自动化程度高等特点。并可与其他分析技术联用。是当今最常用的分析手段。各种测定方法举例：维生素A的分析方法p14维生素B1的分析方法p20维生素B1的分析方法p30维生素B6的含量测定p35维生素B12含量测定方法分析p44维生素C的含量测定方法p50维生素D的分析方法p56多种维生素含量同时测定新法水溶性维生素p脂溶性维生素p维生素A化学结构R=HVA醇VA1R=—COCH3VA醋酸酯R=—COC15H31

VA棕榈酸酯药典方法分光光度法由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料药中混有其他杂质，所测得的吸收度不是维生素A独有的吸收。非维生素A物质的无关吸收所引入的误差可以用校正公式校正，以便得到正确结果。校正公式采用三点法。其他方法改进分光光度法

原理及特点：改进一：使用己烷代替乙醚来提取维生素A，然后再用虹吸的方法将己烷层导出分离，定容。避免了使用乙醚的不安全性，但分离方法仍比较烦琐。改进二：用环己烷代替己烷，省去分离定容过程，直接取上清液用异丙醇稀释后进行比色分析，这种方法既简便又安全。维生素B的测定方法包括：维生素B1

维生素B2维生素B6维生素B12化学结构：氯化3-[（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基]-5-（2-羟乙基）-4-甲基噻唑的盐酸盐维生素B1非水溶液滴定法原理：VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可被高氯酸滴定。特点：可用于弱酸性特别是弱碱性药物及其盐类的含量测定。中国药典以本法取代了硅钨酸重量法测定VB1原料药含量的方法。药典方法紫外分光光度法原理：

VB1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，测定其最大吸收波长处的吸收度即可计算含量。特点：用于VB1片剂和注射剂的含量测定。其它方法硅钨酸重量法原理：2VB1＋硅钨酸→白色沉淀＋4HClVB1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀，根据沉淀的重量和供试品的重量即可计算其含量。

特点：（1）比较准确、灵敏；（2）方法简便，不需要特殊仪器；（3）恒重比较费时间。两点电位滴定法原理：电位滴定的终点可由两点法确定：

Ve＝[(10ΔE/S-1)/(V110ΔE/S-V2)]×V1V2

当V2/V1≤1.04时，公式可简化为：

Ve＝(V210ΔE/S-V1)/(10ΔE/S-1).

V1,V2是滴定终点前附近两点分别消耗标准溶液的体积．△E是相应两次电极电位差，s是电位响应斜率。特点：简便易行，精密度高，测定结果与药典法一致，是测定VB１的简便方法，特别适用于片剂中VB1含量的测定。

荧光反应速率法

原理：

VB1本身没有荧光，先将其氧化为硫胺荧。K3Fe(CN)6氧化VB1的荧光反应和硫胺荧的荧光测定都必须在碱性条件下进行，以NaOH的加入作为反应起点利用荧光分光光度计的时间扫描功能，监视反应的进行，作出工作曲线，以此来测出VB1制剂的含量。特点：反应速度快，反应体系为碱性，与硫色素的荧光测定体系相同，但由于过量的K3Fe(CN)6能使反应产物进一步分解，所以实际工作中利用这个反应进行VB1的荧光光谱法测定时操作要求非常严格，以减少硫色素的进一步分解，才能获得较为满意的结果。离子选择性电极电位滴定法

原理：用氯离子选择性电极为指示电极，甘汞电极为参比电极，AgNO3标准溶液为滴定剂的电位滴定法测定维生素B1含量。特点：仪器价廉，操作方法简便，不需标样，测定结果与药典法基本一致，可用于维生索B1含量的常规测定。间接原子吸收法

原理：在强电解质溶液中，Ag+与VB1中Cl-生成AgCl沉淀，离心沉降，不经过滤分离，直接测其清液中剩余Ag+含量、间接计算出VB1含量。特点：具有线性范围宽，重现性好，快速省时，所用试剂少等优点，利用本法可测定片剂和针剂中VB1含量。

维生素B2化学结构

CH2OH(CHOH)3CH2CH3NNO

CH3NNH

O

药典方法

紫外分光光度法

用于维生素B2原料药、片剂、注射剂的含量测定。其他方法原子吸收光谱法原理:利用高碘酸对相邻羟基的氧化作用有很强的专属性，在弱酸性介质中，它与VB2的反应产物碘酸与硝酸银定量反应生成碘酸银，通过测定Ag+，间接测定了VB2的含量。特点：1、可用无机试剂代替有机试剂作为标准溶液，解决有机试剂难寻找或纯度不高等问题。

2、干扰小，准确度好。NaIO4一VB2化学发光反应体系

原理：在磷酸介质中，过氧化氢存在下，高碘酸钠氧化维生素B2产生强烈的化学发光，且发光强度在一定范围内与维生素B2的浓度呈线性关系。结合流动注射技术测定维生素B2的含量。特点：选择性好，仪器简单，操作简便，灵敏度较高。维生素B6化学结构

CH2OH

HOCH2OHHCl

H3CN药典方法

非水溶液滴定法用于VB6原料药的含量测定紫外分光光度法用于VB6片剂、注射剂的含量测定其他方法流动注射一原子吸收法

原理：在弱酸性介质中，新生态MnO2与维生素B6发生反应，通过FIA-AAS测定反应产物Mn2+，来测定VB6的含量。特点：具有简便、快速、重现性好等优点，用于实际样品的测定，结果与药典法一致。流动注射一化学发光法

原理：在酸性介质中，维生素B6与高锰酸钾发生氧化还原反应并产生化学发光信号，连二亚硫酸钠的存在能使这一反应的化学发光强度大大增强。结合流动注射技术测定维生素B6的含量。特点：快速、灵敏示波极谱滴定法原理：在KCI溶液中，用汞膜电极作极化电极，银棒电极作去极化电极，直接用0.05mol／LNaOH标准液进行滴定，以示波极谱图上的切口消失米指示终点。

特点：终点直观，操作简便，结果准确，且设备简单，成本低廉。两点电位滴定法

原理同VB1的两点电位滴定法测定荧光分光光度法原理：荧光法测定维生素B6原料，激发光谱最大吸收Ex=323nm,发射光谱最大吸收Em=395nm.在0-400ng/ml范围内呈良好线性关系。特点：采用本方法测定，避免了非水滴定法中由于温度变化而使高氯酸标液浓度变化产生的结果偏差，并且对试剂要求不高。维生素B12化学结构药典方法紫外分光光度法适用于维生素B12原料药及注射剂的含量测定其他方法原子吸收光谱法

原理：维生素B12含有元素钴，可用火焰原子吸收光谱法测定维生素B12及注射液的含量。特点：具有回收率良好，操作简便的优点，还可克服分光光度法稳定性较差的缺点，能符合药物原料，制剂含量测定的要求。缝管原子捕集原子吸收光谱法

原理：在上述火焰原子吸收法测定Co的基础上，利用缝管原子捕集技术（即在火焰中浓缩待测原子的预富集技术），提供极高的原子密度，从而显著提高灵敏度。特点：灵敏度高，所需样品少。PAN—Co配合物示波测定

原理：

1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)是一种萃取光度法和光度测定或荧光测定A13+、Cd2+、Co2+、Ga3+等金属离子的显色剂。在适宜的pH值条件下，PAN能与Co2+等多种金属离子形成有色配台物。利用PAN可在NaOH底液中产生灵敏切口且当向其中加入含Co2+的溶液时，PAN的切口随Co2+的加入量线性降低的示波特性，对维生素B12中的钴含量(即维生素B12含量)进行测定。

特点：具有良好的精密度。维生素C化学结构药典方法

碘量法原理：维生素C具有C—C基有还原性，还原性抗坏血酸能还原KIO3中的碘，碘在水溶液中加淀粉指示剂呈兰色，还原型抗坏血酸还原碘后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸，在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准KIO3的量与样品中所含抗坏血酸量成正比。其反应式为：KIO3+5KI+3H2SO43K2SO4+3I2+2H2OI2+抗坏血酸脱氢抗坏血酸+2I-应用：中国药典用此法测定VC原料药、片剂、泡腾片、注射剂、颗粒的含量。其他方法

2,6-二氯吲哚酚滴定法原理：

在酸性下氧化型是红色的;还原型是无色的。酸性下直接用2,6-二氯吲哚酚滴定，用滴定剂自身的颜色变化指示终点，不需要另外的指示剂。特点：专属性较碘量法高，多用于含VC的制剂及食品的分析。快速酶电极法原理：VC溶液与酶作用时用氧电极测定氧的消耗量，就可求出溶液中VC的含量。特点：准确度高、所需时间短、操作简便、试剂消耗低，并具有良好的线性关系，是工业测试的一种新手段。快速比色法原理：维生素C与Fe(III)一邻菲罗啉复合物反应生成Fe(Ⅱ)一邻菲罗啉复合物，后者在510nm波长处有最大吸收。用比色法直接测定维生索C注射液的含量。特点：与碘量法比较，本法操作简便、快速、灵敏，可作为医院、药厂对维生素C注射液及其中间品质量监测的参考。维生素D2化学结构

HO药典方法

正相高效液相色谱法适用于VD2原料药、注射液、胶丸的含量测定其他方法反相液相色谱法

色谱条件：以苯并芘为内标，也能获得较为满意的结果。维生素E化学结构

OOH3CCO药典方法

气相色谱法

适用于VE原料药、片剂、注射液、胶丸的含量测定特点：该法可去除杂质，专属性强，准确度高，但仪器价格昂贵，操作繁琐。其他方法铈量法

原理：利用VE水解后生成游离生育酚，具有还原性，可被硫酸铈定量氧化来测定VE的含量。特点：简便易操作，对仪器要求不高，但终点不明显，分析结果重现性差，误差较大。

二阶导数光谱法原理：在二阶导数光谱中，以维生素E波长288nm和292nm相邻谷峰处的振幅(峰-谷法)D值作为定量分析信息。特点：采用二阶导数的方法能很好地消除干扰，且方法简便，适合医院制剂快速检测。正交函数分光光度法原理：通过适当数学处理而消除不相关吸收的一种方法。用正交函数分光光度法测定维生素E胶丸中的维生素E含量，选择二次正交多项式，波长区间250～300nm，波长间隔为4nm，6个测试点。特点：操作简便，结果的准确度和精密度均较满意。且对仪器要求不高，不需要昂贵的仪器，用一般普通型的分光光度计即可