药物分析第13章A生化药物和基因工程药物分析概念课件

第十三章生化药物和基因工程药物

分析概念

基本要求概述质量检验的基本程序与方法常用定量分析方法及其应用

练习与思考

返回主目录基本要求

1．掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。2．掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。3．熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。4．了解本类药物含量测定的其他方法。返回一、防病、治病的三大药源

第一节概述2.基因工程药物：以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。DNA重组技术（基因工程）：生产过程为天然基因合成的核苷酸序列内切酶连接酶载体重组的遗传物质转移到宿主细胞增殖、表达分离纯化目的产物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物1．生化药物

三、特点

1.生物体的基本生化成分

2.分子量大:分子量测定

3.结构难确证

4.全过程的质量控制：原料、生产过程、

最终产品

5.生物活性检查

6.安全性检查

7.效价（含量）测定：

理化法：有效成分的含量

效价测定和酶活力测定：有效成分的生物活性返回

生化药物和基因药物质量控制的项目：

来源与种类纯度

性状干燥失重或水分

鉴别炽灼残渣

氨酸组分分析生物活性

肽图热源试验

糖含量含量分析

第二节质量检验的基本程序与方法

（一）理化鉴别法1.化学鉴别法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+络合显色

2.紫外分光光度法

溶剂：0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠浓度：20μg/ml判断：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。

4.酶法：例：尿激酶的鉴别---气泡上升法原理：5.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。

6.生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。（二）杂质检查

一般杂质检查

特殊杂质检查：原料药纯度分析

生产过程中杂质的检查

1.原料药纯度分析：

多糖类-----低聚糖、核酸、蛋白质

酶类药物-----酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。

（三）安全性试验

热源试验

异常毒性试验:急性毒性物质

过敏试验：异性蛋白

降压物质试验：导致血压降低的杂质、组

胺、类组胺

无菌试验：活菌

基因工程药物中可能杂质与污染物检查

来源于宿主细胞的残留DNA，外源性杂质

致突变试验

生殖毒性试验（四）含量测定

生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量：适用于结构明确的小分子药

物或经水解后变成小分子的

药物。

生物效价或酶活力单位：适用于酶类、

蛋白质类药物。

1．电化学分析法药物膜电极

生物组织膜电极

药物电极微生物电极

离子选择性电极法免疫电极

免疫场效应管

酶电极

第三节常用定量分析方法及其应用

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸

柱：RP—18，柱温：48℃

流动相：A--0.05%TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）

梯度洗脱

荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm2）HPIEC测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相：0.3mol/L～1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点：可回收活性蛋白。

3）HPGFC应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%叠氮化钠标准蛋白分子量曲线的制备：醛缩酶血清白蛋白右旋糖苷蓝碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸T0完全排阻完全进入填料空隙Tt标准蛋白分子量曲线：Kd--lgM.W.

样品测定：

应用示例：ChP（2000）重组人胰岛素的质量控制1）鉴别：

法1：在效价测定项下，供试品主峰的保留时间应与对照品的一致。

法2：供试品与对照品分别经过酶解后，再分别进行梯度洗脱，供试品的肽图谱与对照品的肽图谱一致。2）检查：检查项目：有关物质、高分子蛋白、锌、氮、干燥失重、无菌、细菌内毒素。有关物质：供试液经梯度洗脱，按峰面积归一化法计算有关物质的量不得超过3.0%。高分子蛋白质：

固定相：色谱用亲水硅胶，它可以分离分子量

为5000～6000的球状蛋白。

流动相：0.4mol/L碳酸氢铵-乙腈（69:31）

测定：分别测定供试液（1mg/ml）和对照液（将供试液稀释成0.01mg/ml），供试液显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不大于对照液主峰面积（限量1.0%)。

3）效价测定：

固定相：ODSC18

流动相：硫酸盐缓冲液-乙腈（74︰26）

系统适用性试验：测定胰岛素主峰和A21脱氨胰岛素峰之间的分离度与拖尾因子。

含量测定：分别进样供试液和对照液，按峰面积外标法计算含量。3.灌注色谱法固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交联结构上构成贯穿孔颗粒分离介质----PO