基因在大肠杆菌酵母中的高效表达

基因在大肠杆菌酵母中的高效表达基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第1页基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第2页5.2.1.2酵母菌表示外源基因优势基因表示调控机理清楚，遗传操作简便含有真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表示产物分泌至培养基中不含有特异性病毒、不产内毒素酵母菌是最简单真核模式生物基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第3页5.2.2酵母菌宿主系统广泛用于外源基因表示酵母宿主菌提升重组蛋白表示产率突变宿主菌抑制超糖基化作用突变宿主菌降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第4页5.2.2.1广泛用于外源基因表示酵母宿主菌当前已广泛用于外源基因表示和研究酵母菌包含：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第5页4.2.2.2提升重组蛋白表示产率突变宿主菌ssc1

改进重组蛋白分泌钙离子依赖型ATP酶ssc2

提升重组蛋白表示转录后加工rgr1

提升重组蛋白表示转录水平ose1

提升重组蛋白表示转录水平ssc11

改进重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提升重组蛋白表示转录水平突变类型生物效应作用位点基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第6页4.2.2.3抑制超糖基化作用突变宿主菌能抑制超糖基化突变类型mnn甘露糖生物合成缺点型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺点型och外侧糖链添加缺点型突变类型生物效应许多真核生物蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们经常影响蛋白质生物活性。整个糖单位由糖基关键和外侧糖链两个别组成。

酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白糖基化反应极难控制，呈超糖基化倾向，所以超糖基化缺点株非常主要。基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第7页4.2.2.4降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌泛素介导蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第8页酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI2

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI3

编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长久表示稳定时关闭UBI4

编码泛素五聚体对数生长久关闭稳定时表示酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第9页泛素降解路径衰减酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表示，UBI4-突变株能UBI4缺点型：正常生长，但细胞内游离泛素分子浓度比野生株要低得多，所以UBI4缺点突变株是外源基因表示理想受体UBA1缺点型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性，但其等位基因缺点是非致死性，而且也能减弱泛素介导蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因突变对衰减蛋白降解作用一样有效基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第10页4.2.3酵母菌载体系统酵母菌克隆表示质粒构建酵母菌中野生型质粒基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第11页4.2.3.1酵母菌中野生型质粒酿酒酵母中2m环状质粒几乎全部酿酒酵母中都含有2m双链环状质粒，拷贝数达50至100个。同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第12页乳酸克鲁维酵母中线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不一样pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亚基双链线状质粒pGKL1和pGKL1反向重复序列基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第13页4.2.3.2酵母菌克隆表示质粒构建(1)含有ARSYRp质粒构建ARS为酵母菌中自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒构建组成包含复制子、标记基因、提供克隆位点大肠杆菌质粒DNA。

以ARS为复制子质粒称为YRp上述两类质粒在酿酒酵母中拷贝数最高可达200个，但培养几代

以2m质粒上复制元件为复制子质粒称为YEp后，质粒丢失率高达50%-70%，主要是因为分配不均匀所致。基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第14页(2)含有CENYCp质粒构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配相关序列将CENDNA插入含ARS质粒中，取得新载体称为YCpYCp质粒含有较高有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第15页(3)含有酵母菌染色体DNA同源序列YIp质粒构建

在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标识基因，构建出来质粒称为Yip（酵母整合型质粒），目标基因表示盒通常插在染色体DNA特定序列中。

什么目标？目标基因能高效整合入酵母菌特定染色体DNA区域基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第16页4.2.4酵母菌转化系统酵母菌转化程序转化质粒在酵母细胞中特点用于转化子筛选标识基因基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第17页(1)酵母菌原生质体转化法早期酵母菌转化都采取在等渗缓冲液中稳定原生质体转化法原生质体转化法一个显著特点是：一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子4.2.4.1酵母菌转化程序基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第18页(2)碱金属离子介导酵母菌完整细胞转化

酿酒酵母完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且含有以下特征：吸收线型DNA能力显著大于环状DNA，二者相差80倍共转化现象极为罕见基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第19页(3)酵母菌电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应防止使用PEG，它对受电击细胞含有较很大负作用。电击转化优点是不依赖于受体细胞遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105/mgDNA。基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第20页4.2.4.2

转化质粒在酵母细胞中特点单双链DNA均可转化酵母菌含有复制子单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体克隆在YIp整合型质粒上外源基因，含有受体细胞染色体DNA同源序列，会发生高频同源整合基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第21页4.2.4.3

用于转化子筛选标识基因用于酵母菌转化子筛选标识基因主要有营养缺点型互补基因和显性标识基因两大类

营养缺点型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺点型受体非常困难(1)营养缺点型互补基因基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第22页显性标识基因编码产物主要是毒性物质抗性蛋白(2)显性标识基因aph

氨基糖苷转移酶抗G418cat

氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr

二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

铜离子螯合物耐受铜离子suc2

蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标识基因编码产物遗传表型基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第23页4.2.5酵母菌表示系统外源基因在酵母菌中表示限制原因酵母菌开启子可控性酵母菌表示系统选择基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第24页4.2.5.1酵母菌开启子可控性

酿酒酵母PHO5开启子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开，PHO4基因编码产物是PHO5开启子正调控因子

PHO4温度敏感型突变基因pho4TS编码产物在35℃时失活开启子下游外源基因在35℃时关闭，23℃诱导表示(1)温度控制型开启子-pho4TS-PHO5开启子：基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第25页酿酒酵母半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因编码(2)超诱导型开启子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不显著，基因基底水平表示GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表示，GAL1、GAL1、GAL10超高效表示GAL10Promoter基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第26页4.2.5.2外源基因在酵母菌中表示限制原因外源基因稳态mRNA浓度外源基因mRNA翻译活性酵母菌对密码子偏爱性在酿酒酵母中，高丰度蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上氨基酸是由25个密码子编码基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第27页4.2.5.3酵母菌表示系统选择酿酒酵母基因表示系统最为成熟，包含转录活性较高甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属开启子，各种重组外源蛋白取得成功表示。酿酒酵母表示系统最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺点可用非酿酒酵母型表示系统来填补。A酿酒酵母表示系统基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第28页

乳酸克鲁维酵母双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产高效表示稳定性载体，即便在无选择压力条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表示分泌型和非分泌型重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表示系统。B乳酸克鲁维酵母表示系统基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第29页巴斯德毕赤酵母是一个甲基营养菌，甲醇可高效诱导甲醇代谢路径中各酶编码基因表示。

生长快速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强开启子、表示可诱导性是巴斯德毕赤酵母表示系统三大优势。无适当自主复制型载体，外源基因高效表示在很大程度上取决于整合拷贝数多寡。（20余种重组蛋白）C巴斯德毕赤酵母表示系统基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第30页多型汉逊酵母也是一个甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表示载体，但与巴斯德毕赤酵母相同，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不一样是，HARS质粒能高频自发地整合在受体染色体DNA上，甚至能够连续整合100多个拷贝，所以重组多型汉逊酵母构建也是采取整合策略。当前，包含乙型肝炎表面抗原在内数种外源蛋白在该系统中取得成功表示。D多型汉逊酵母表示系统基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第31页产乙肝表面抗原重组酿酒酵母乙型肝炎病毒结构与性质产乙肝表面抗原重组巴斯德毕赤酵母4.2.6利用重组酵母生产乙肝疫苗基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第32页病毒颗粒主要结构蛋白是病毒表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽颗粒内蛋白成份包含关键抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白4.2.6.1乙型肝炎病毒结构与性质基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第33页乙型肝炎病毒包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa基因在大肠杆菌酵母中的高效表达第34页乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，所以第一代乙肝疫苗是从病毒携带者肝细胞质膜上提取出来。即使这种质