细胞器生物化学研究进展

细胞器生物化学研究进展摘要生命体结构和功能的基本单位是细胞，而维持生命体正常运行的物理过程、化学过程和能量过程都定位发生在特定的细胞器中，不同的细胞器在细胞活动中有着不同的作用和功能。本文在已有的研究基础上综述了生物膜结构及功能，线粒体功能和线粒体疾病，叶绿体功能及核糖体，并对各种细胞器未来研究方向做了展望。关键字细胞器；生物膜；线粒体；叶绿体；核糖体；引言细胞器是细胞中具有一定结构和功能的微结构。细胞中的细胞器主要有：线粒体、内质网、中心体、叶绿体，高尔基体、核糖体等。它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常的工作和运转。细胞的外周膜(质膜)与细胞内的膜系统(如线粒体膜，叶绿体膜，内质网膜，高尔基体膜，核膜等)统称为生物膜。细胞的能量转换、信息识别与传递、物质运送等基本生命过程都与生物膜密切相关。近年来，在已有关于生物膜和细胞器结构功能研究的基础上，对细胞器疾病机理以及在生物科学领域的应用研究取得巨大成功。生物膜生物膜是由脂类、蛋白质以及糖等组成的超分子体系(图1)[1]。膜蛋白是生物膜功能的主要体现者，膜脂除了具有对膜结构的支撑作用，近年来的研究表明，它们还与信号传递等功能有密切的联系。质膜主要由膜脂和膜蛋白组成，另外还有少量糖，主要以糖脂和糖蛋白的形式存在。膜脂是膜的基本骨架膜蛋白是膜功能的主要体现者，膜脂除了具有对膜结构的支撑作用外，近年来的研究表明，它们还与信号传递、物质跨膜运输等功能有密切的联系。图1生物膜结构模式图研究者对膜提出了多种结构模型，最经典的是1972年Singer和Nicolson提出的流体镶嵌模型，该模型是人们理解膜结构和功能的经典理论基础。它强调了膜的流动性和膜蛋白质在膜脂中分布的不对称性。随着实验技术的不断创新和改进，对膜组分的动态结构、膜组分之间的关系和膜的生理功能等都作了大量深入的研究。但是随着对膜结构与功能研究的深入，人们发现膜脂的分布也是不对称和不均一的。不同膜微区具有不同膜脂与蛋白质组成，因而具有不同的理化性质及生物学功能。实际上生物膜是一个由许多不同微区组成的微观上相对独立而宏观上绝对联系的对立统一体系，正是这种特殊的膜体系才能使膜具有复杂而多变的功能。1988年Smon提出了脂筏(lipidraft)模型。2001年在西班牙召开了欧洲研讨会，会议期间对膜的微区、脂筏及小窝作了专题讨论。脂筏是指膜脂质双层内含有特殊脂质与蛋白质的微区，直径约为50-350nm，微区内陷可形成囊泡(胞膜窖或小窝)。脂筏不仅存在于细胞质膜上，而且高尔基体膜上也有脂筏[2]。2、线粒体线粒体被称为“能量工厂”，人体至少有90%的能量由其产生。在人体各个细胞都存有线粒体，单个细胞包含200-2000个线粒体，但是不同组织的细胞内线粒体的数量是不同的，而在相同组织的细胞内线粒体数量是接近的[3]。线粒体是真核细胞内的重要细胞器，是能量产生与转换的场所，还参与脂肪酸的合成及少量蛋白质的合成线粒体有自己的一套遗传控制系统，同时也受到核DNA的控制线粒体DNA(mtDNA)缺失或点突变，使编码线粒体氧化代谢过程必需的酶或载体发生障碍，糖原和脂肪酸等不能进入线粒体充分利用和产生足够的ATP，导致能量代谢障碍和产生复杂的临床症状称为原发性线粒体病。线粒体病按病因学可分为原发性和继发性:原发性线粒体病是由于mtDNA或nDNA的突变造成线粒体功能障碍；继发性线粒体病则是由于各种继发性原因所致的线粒体功能障碍，如炎症药物或毒物以及其他疾病等。自从1988年首次报道线粒体突变以来，已确认100种以上的致病点突变;200种缺失、插入与重排，其中大约60%的点突变影响线粒体tRNA，35%的影响呼吸链的多肽亚单位，另有5%累及线粒体rRNA。线粒体病的最基本的病理过程是线粒体不能产生足够的ATP，因此对其治疗的最终目的是增加肌体ATP的产生，具体措施包括饮食治疗、代谢治疗、成肌细胞移植治疗、基因治疗，还要注意进行对症治疗[4]。现在研究的有三种治疗线粒体疾病的基因治疗途径。第一是将克隆有正常mtDNA的表达载体导入到核内，在细胞质表达蛋白质产物，然后定向进入线粒体；第二是转染野生型DNA或RNA进入线粒体，造成顺式或反式调控作用，反式互补是指导入的核酸特异的与突变型mtDNA重组，成为野生型mtDNA，顺式互补是将外源基因通过表达载体系统导入线粒体，使之表达野生的基因产物，以弥补其不足。第三是去除突变型mtDNAmtDNA复制的单链形成期，将反义的序列特异的寡核苷酸与之结合，可抑制突变型的复制[5]。对线粒体病的研究应着重于其预防方面，包括分子生物学机制以及基因诊断技术的研究相信在不远的将来对于线粒体病的预防减少患病婴儿的出生必将获重大突破。3、叶绿体叶绿体是光合作用的器官，是除细胞核外存在遗传物质的细胞器之一。叶绿体基因组DNA是环状分子，能进行自主复制。叶绿体基因组仅编码约有80-100种蛋白质，其他约2500-3500种蛋白质由核基因组编码。植物叶绿体由前质体分化而来，在进化上源于内共生细菌，因而叶绿体保留了许多原核细胞的特性，如多顺反子、基因转录及蛋白质翻译，均与细菌相似[6]。光合作用发生在叶绿体内，因而成为推进早期生命进化的能量源头，全面了解叶绿体基因组，对今后深入研究和充分发挥叶绿体功能具有重要意义。近年来，随着分子生物学，尤其是大规模测序技术的不断发展，对叶绿体基因组的研究日益深入。从1986年首次获得烟草(Nicotianatabacum)和地钱(Marchantiapolymorpha)叶绿体基因组的完整序列以来，叶绿体基因组数据库迅速增加充实。叶绿体基因组DNA(chloroplastDNA，cpDNA)一般为双链环状分子，极少数为线状，如伞藻(Acetabularia)。叶绿体基因组的大小差别也比较大，如微管植物叶绿体DNA一般为120～160kb，被子植物120kb。叶绿体基因组中含有大量的功能基因，可分成3类，即和光合作用有关基因，和基因表达本身有关的基因和其他生物合成有关的基因。图2烟草叶绿体基因组图谱与核转基因技术相比，叶绿体转化具有明显的优势，主要表现在以下几个方面：a、表达效率高且外源基因可以定位整合；b、可以直接表达来自原核的功能基因；c、多基因可以同时转化，提高转化效率；d、没有载体序列、位置效应和多效性；e、没有核转化中经常出现的基因沉默现象；f、属于母性遗传，后代材料稳定；g、可有效控制花粉漂移造成的基因污染，环境安全性高等一系列优势。研究叶绿体基因组的进化可以更深入地了解不同植物之间的亲缘关系，叶绿体基因的转录、剪切、表达规律以及与核基因组之间的信息交流等，为载体设计、提高转化后同质化效率等提供有利信息。所以，将植物叶绿体作为生物反应器进行生物制药、表达药用蛋白和疫苗，具有许多独特的优势。它可以大大降低生产和运输成本、外源蛋白稳定性高、易于纯化等。这些独特的优势使叶绿体基因组成为生产食用蛋白和人类药用蛋白的理想平台[7]。Lentz等在烟草叶绿体中高效表达了含有口蹄疫病毒VP1蛋白135-160种免疫表位氨基酸残基的口蹄疫病毒蛋白。SoriaGuerra等[在烟草叶绿体中成功表达了包含白喉棒状杆菌、百日咳和破伤风杆菌的具有免疫保护源性的外毒素抗原表位融合蛋白DPT。我国植物叶绿体基因组转化研究起步较晚，截止到目前已建立了烟草、油菜、水稻等植物的叶绿体转化体系。中国科学院侯丙凯等以油菜子叶柄为外植体，成功实现了油菜叶绿体基因组的定点转化，将外源基因cry1A转入油菜，用转基因植株的叶片饲喂二龄小菜蛾发现幼虫死亡率较高，存活幼虫的生长也受到了明显的抑制[8]。经过近年来的不懈努力，叶绿体转基因技术获得了巨大的进步，并为叶绿体转化技术向其他植物扩展奠定了基础。叶绿体转化后的筛选过程是冗长和复杂的，但由于它独特的优点和在外源蛋白表达、积累方面的巨大优势，叶绿体基因技术仍值得继续进行深入研究。4、核糖体核糖体是主要由RNA和蛋白质构成的核糖核蛋白颗粒，是细胞内按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链的蛋白质合成的分子机器。核糖体无膜结构，主要由蛋白质（40%）和RNA（60%）构成。核糖体按沉降系数分为两类，一类（70S）存在于细菌等原核生物中，另一类（80S）存在于真核细胞的细胞质中。他们有的漂浮在细胞内，有的结集在一起。4．1核糖体蛋白核糖体蛋白质(ribosomalprotein，RP)是一种广泛存在的RNA结合蛋白，既往认为RP的功能仅仅是与核糖体RNA(rRNA)共同参与蛋白质的合成。近年来，随着技术手段的进步和科学研究的深入，RP的其他功能越来越多地被人们发现，对于RP功能的探索成为科学领域的一大热点。目前发现组成核糖体的RP有80多种。RP在进化过程中高度保守，其氨基酸序列在几乎所有哺乳动物中均相同，在原核细菌、真菌和酵母菌中也极其相似。RP根据来源的大小亚基分别被命名为RPL和RPS，在蛋白质合成过程中起重要作用。例如，对rRNA进行折叠，使其形成能行使功能的三维结构；调整核糖体的空间构象，使其与RNA结合进行蛋白质合成等。近年来，越来越多的研究发现，RP具有诸多复杂的核糖体外功能。对于核糖体外功能的界定，有学者给出了三条基本标准：(1)RP可以与细胞内的其他非核糖体组分相互作用；(2)这种相互作用会对细胞产生某些生理效应；(3)该生理效应的产生与核糖体本身的功能无直接关系。目前研究发现的RP的核糖体外功能主要包括：参与调控基因的转录和翻译、调控细胞增殖、凋亡、分化等。RP表达异常还会引起贫血、肿瘤等严重疾病。这些证据均表明，RP具有强大的核糖体外功能，对这些功能的深入研究对于认识其生物机制、预防和治疗疾病都有重要的意义。核糖体的结构、功能和工作机理一直是科研工作者研究的重点，RP的功能也得到了越来越多的学者关注。目前，已经明确了RP的氨基酸序列和空间结构，它们在蛋白质合成中的重要作用也得到了认同，对于核糖体外功能的研究越来越深入。已有大量文献报道了RP的各种生理功能，RP在某些疾病的发生、发展和治疗中都起着重要作用，但是对于其确切的作用机制研究甚浅，这就需要广大医药工作者的大量研究来探索和确证[9]。4．2植物核糖体失活蛋白核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)的发现距今已有一百多年的历史，分别是从蓖麻(Ricinuscommunis)中提取的蓖麻毒蛋白(ricin)和从相思子(Abrusprecatorius)中提取的相思子毒蛋白(abrin)。但是准确提出核糖体失活蛋白这个命名，是在发现了它们能够使核糖体失去活性，又发现了一系列相关蛋白之后。除了在几种真菌和细菌中发现RIPs之外，几乎所有的RIPs都来自于高等植物。至今，已经发现了百余种RIPs，其生物活性，如抗病毒、抗肿瘤活性等引起了人们的广泛关注。一般来说，RIPs分为三类Ⅰ型RIPs，由相对分子质量为30000左右的单肽链组成。Ⅱ型RIPs，由A链(RTA)和B链(RTB)组成，A链结构类似于Ⅰ型核糖体失活蛋白，具有酶活性，其相对分子质量略大，约35000左右；B链对半乳糖结构具有特定的凝集素活性。Ⅲ型RIPs，主要包括两种RIPs，一是玉米(Zeamays)毒蛋白(b-32)，它在移除了内部的一个短肽片段后，才具有酶活性，这一过程产生了两条肽链亚基，相对分子质量为16500和8500。另一种是大麦(Hordeumvulgare)毒蛋白(JIP60)，在JIP60中有一段类似于Ⅰ型RIPs的片段，另外连接着一个长度相似但功能未知的片段。因RIPs具有细胞毒性和酶活性使得20世纪70年代以来RIPs成为研究的热点。RIPs作用于哺乳动物细胞会导致细胞凋零。Sha等发现了ricinR与蓖麻凝集素(R.communisagglutinin，RCA)都会导致小鼠视网膜炎，并考察了天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)对小鼠眼睛的伤害作用，发现TCS选择性进入和破坏Müller细胞和色素上皮细胞，从而使线粒体退化，最终导致细胞凋亡[10]。许多学者对RIPs在转基因植物，肿瘤治疗和HIV治疗上的应用进行了大量的研究。随着现代技术的发展，RIPs的分子机制以及毒性、活性机制都在逐步深入。很明显，破坏核糖体RNA已经不能解释它具有其他众多的生物活性，而解旋DNA和其它核苷酸载体的作用机制还有待于进一步研究。同时，现在主要的热点在转基因植物的应用中，来抵抗病毒及病虫的侵害。但是这些修饰过的植物对人体是否有害还有待考证