第五章基因的分离与鉴定

DNA克隆片段的产生和分离重组体DNA分子的构建及导入受体细胞基因克隆的实验方案

克隆基因的分离

重组子的选择与鉴定目前一页\总数七十九页\编于八点克隆基因的分离1.应用核酸探针2.应用差别杂交或扣除杂交法3.应用mRNA差别显示技术4.应用表达文库5.酵母双杂交体系目前二页\总数七十九页\编于八点应用核酸探针分离克隆的目的基因目前三页\总数七十九页\编于八点步骤：1.获得探针2.转膜3.杂交目前四页\总数七十九页\编于八点TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectly

BacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization

(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washto

removeunhybri-dizationprobeand

visualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled

)

antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeled

Lineup

thehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)目前五页\总数七十九页\编于八点探针的来源1.某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为从其它生物中分离相关基因的核酸探针。

2.根据蛋白质家族保守性，合成核酸探针。功能相同或相近的蛋白质，存在着具有共同氨基酸序列的区段（保守区），往往由彼此相邻的6~7个氨基酸组成。

目前六页\总数七十九页\编于八点寡核苷酸探针的人工合成

1.探针的长度；要使探针与目的基因序列严格互补，最少的探针长度15~16个核苷酸，实验中为保证足够的特异性，通常使用17~20个核苷酸。2.简并性；根据蛋白质氨基酸组分合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式。在这种探针库中，只有一种是与目的基因完全互补的。目前七页\总数七十九页\编于八点由于探针库中只有一种是与目的基因完全互补的，其它的探针有可能与不相关的片断杂交，产生假阳性信号。1.猜测体探针

2.PCR-猜测体探针目前八页\总数七十九页\编于八点猜测体：一种人工合成的用于分离克隆基因的低简并性的寡核苷酸探针，其核苷酸序列是根据特定物种当中某种已知蛋白质的密码子使用频率，同时又采纳了根据猜测最可能在目的基因中出现的密码子资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行合成。一种较长的唯一的寡核苷酸序列，它能够大范围的却不能够完全的同靶序列互补。目前九页\总数七十九页\编于八点目前十页\总数七十九页\编于八点PCR-猜测体探针（尿酸氧化酶基因）根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物，以cDNA为模板用猜测探针杂交筛选阳性克隆目前十一页\总数七十九页\编于八点应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因目前十二页\总数七十九页\编于八点差别杂交（differentialhybridization）又称差别筛选(differentialscreening)适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA。扣除杂交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractivecDNAcloning）通过构建扣除文库得以实现。目前十三页\总数七十九页\编于八点差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。目前十四页\总数七十九页\编于八点目前十五页\总数七十九页\编于八点差别杂交的局限性：1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。目前十六页\总数七十九页\编于八点扣除杂交：去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集。目前十七页\总数七十九页\编于八点目前十八页\总数七十九页\编于八点应用mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）分离克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)目前十九页\总数七十九页\编于八点原理：用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。目前二十页\总数七十九页\编于八点

P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12种序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’3’-锚定引物：目前二十一页\总数七十九页\编于八点目前二十二页\总数七十九页\编于八点10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3’-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。5’-随机引物目前二十三页\总数七十九页\编于八点由于在cDNA群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的mRNA的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要PCR扩增。DDRT-PCR目前二十四页\总数七十九页\编于八点1.从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA;2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离基本过程：目前二十五页\总数七十九页\编于八点4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断；5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增；6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序；7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。目前二十六页\总数七十九页\编于八点目前二十七页\总数七十九页\编于八点1.可以同时比较多个样品表达的差异；2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因；3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来；4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。优点：目前二十八页\总数七十九页\编于八点

1.假阳性比例高（50%～75%）；同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针

2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）；

局限性：目前二十九页\总数七十九页\编于八点应用表达文库分离克隆的目的基因目前三十页\总数七十九页\编于八点当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。表达文库分离克隆的目的基因目前三十一页\总数七十九页\编于八点1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。2.cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。特点：目前三十二页\总数七十九页\编于八点1.利用抗体筛选表达文库；2.测定蛋白质的功能；3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。筛选的方法：目前三十三页\总数七十九页\编于八点将菌落或噬菌斑原位复制到膜上处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体能与第一抗体结合抗体筛选表达文库目前三十四页\总数七十九页\编于八点生物化学研究表明，存在Ca＋＋离子的条件下，钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选cDNA表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。2.测定蛋白质的功能目前三十五页\总数七十九页\编于八点鉴定能够表达出与特定DNA片断（真核启动子中与转录因子结合的DNA元件）结合的目标蛋白质的克隆。3.用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库目前三十六页\总数七十九页\编于八点酵母双杂交体系

（two-hybridsystem）目前三十七页\总数七十九页\编于八点有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。应用于真核基因地表达调控，细胞粘合因子间的相互作用、信号转导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等研究酵母双杂交体系又叫相互作用陷阱(interactiontrap)目前三十八页\总数七十九页\编于八点许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域组成（example）；应用重组DNA技术，也可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的、分开的两种结构域，在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的报告基因的表达。基本原理：目前三十九页\总数七十九页\编于八点酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸区段有一个结合域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸区段有一个转录激活域（transcriptionactivationdomain,AD）DNA-BD能识别激活序列并与之结合；AD通过同转录机制中的其它成份之间的结合作用启动下游基因进行转录。用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中表达，也不会直接发生相互作用不能激活相关的效应基因进行转录。Example:目前四十页\总数七十九页\编于八点寄主菌株：剔除掉GAL4基因的酿酒酵母1.SFY526和HF7c带有报告基因lacZ、HIS3和LEU22.还有两种可以在大肠杆菌和酵母中自主复制的穿梭载体a.

pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正确的取向和读码结构被克隆在载体的多克隆位点区内，于是靶蛋白和GAL4-BD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质b.第二种质粒载体pGAD424(AD质粒载体)用来构建cDNA表达文库专用载体，克隆cDNA片断是按正确的取向和读码结构插入在载体的多克隆位点区内，因此由cDNA编码的蛋白质便会同GSL4-AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质。

目前四十一页\总数七十九页\编于八点目前四十二页\总数七十九页\编于八点目前四十三页\总数七十九页\编于八点目前四十四页\总数七十九页\编于八点选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；构建带有GAL1UAS-启动子-lacZ（His3）的转化载体;把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。

e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。酵母双杂交体系的主要实验过程：go目前四十五页\总数七十九页\编于八点

1.遗传检测法2.物理检测法3.菌落或噬菌斑杂交筛选法4.免疫化学检测法5.蛋白质筛选法6.转译筛选法重组子分子的选择与鉴定目前四十六页\总数七十九页\编于八点重组子、目的重组子与非目的重组子由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子目前四十七页\总数七十九页\编于八点

该方法要求克隆基因能够表达，并利用相应的基因突变型作为受体细胞，当受体细胞由突变型变为野生型时或赋予受体细胞特定的表型时，我们基本可以确定所克隆的基因是否是目的基因优点：简便、快速，结果较可靠缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞遗传检测法目前四十八页\总数七十九页\编于八点1.根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法a.抗药性记号插入失活选择法b.β-半乳糖苷酶显色反应选择法目前四十九页\总数七十九页\编于八点目前五十页\总数七十九页\编于八点抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs目前五十一页\总数七十九页\编于八点抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子目前五十二页\总数七十九页\编于八点显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等目前五十三页\总数七十九页\编于八点显色筛选法的基本操作将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落目前五十四页\总数七十九页\编于八点2.根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法

转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。目前五十五页\总数七十九页\编于八点Example:

λgt.λB噬菌体（由于C片断的缺失而造成重组缺陷的λred－噬菌体），在大肠杆菌ligts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。将具有连接酶基因的重组体噬菌体λgt.λB，涂布在大肠杆菌ligts菌株上时，通过寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功能的重组体噬菌体。

目前五十六页\总数七十九页\编于八点缺点：不单要求克隆的DNA片断必须大到括足以包含一个完整的基因，而且还要求所编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能表达。（对于真核基因很难达到要求）目前五十七页\总数七十九页\编于八点物理检测法

1.凝胶电泳检测法

利用凝胶电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其长度

优点：简便、快速

缺点：只能提供克隆片段大小的信息

目前五十八页\总数七十九页\编于八点2.R-环检测法：鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源区域

在临近双链DNA变性温度下和高浓度的甲酰胺溶液中（70%），双链的DNA-RNA分子比双链的DNA-DNA分子更加稳定。在这种条件下，RNA会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的RNA-DNA，而被取代的另一条DNA呈单链状态。这种由双链RNA-DNA和单链DNA形成的泡状体称R-环结构目前五十九页\总数七十九页\编于八点目前六十页\总数七十九页\编于八点

包括菌落或噬菌斑的原位杂交技术

优点：方法简便、快速。

缺点：必须具有相应的探针。分子杂交技术检测法目前六十一页\总数七十九页\编于八点菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据目前六十二页\总数七十九页\编于八点菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜用X光胶片覆盖薄膜感光目前六十三页\总数七十九页\编于八点

利用免疫学的原理，检测克隆基因的表达产物。免疫化学检测法目前六十四页\总数七十九页\编于八点

该方法类似于原位杂交法优点：方法简便，一次可检测大量的克隆子缺点：克隆基因必须表达并具有相应的抗体1.放射性抗体检测法目前六十五页\总数七十九页\编于八点1.免疫血清含有几种IgG抗体，识别抗原分子上不同定子，并分别同各自识别的抗原定子相结合；2.抗体分子或抗体的F（ab）部分，能够牢固的吸附在固体基质上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脱掉；3.通过体外碘化作用，IgG抗体会迅速的被放射性同位素125I标记上。

原理：目前六十六页\总数七十九页\编于八点1.菌落溶解释放出抗原蛋白质；a.把平板放置在氯仿蒸气中；b.用烈性噬菌体的气溶胶喷洒；c.用带有能被热诱发的原噬菌体的寄主菌处理。2.将连结在固体支持物上的抗体缓慢的同溶解的细胞接触，形成抗原－抗体复合物3.将固体支持物取出，与放射性标记的第二种抗体温育；4.放射自显影检测。步骤：目前六十七页\总数七十九页\编于八点用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印裂解平板轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定与II125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光放射免疫原位杂交鉴定目前六十八页\总数七十九页\编于八点细菌菌落溶解，释放出抗原蛋白质目前六十九页\总数七十九页\编于八点双位点检测法：适用于含有杂种多肽菌落分析。杂种多肽A–B（A）抗体（B）抗体固定在固体基质125I标记目前七十页\总数七十九页\编于八点滤膜抗体溶液放射性标记抗体检测法的操作程序聚乙烯薄膜培养皿及菌落放射性标记抗体检测法的操作程序目前七十一页\总数七十九页\编于八点

在生长菌落的