细胞转染试剂产品销售专员培训资料

掀起Polyplus转染风暴——产品专员培训JPolyplus-transfection目前一页\总数七十三页\编于十九点转染方法介绍：显微注射法电穿孔法

(Amaxa)Biolistic颗粒传递法

（基因枪粒子轰击法）磷酸钙法阳离子脂质体法（Invitrogen，Roche，Qiagen）阳离子聚合物

(Sunma梭华，凯基，polyplus)物理方法化学方法病毒介导法目前二页\总数七十三页\编于十九点

转染的应用：基因组功能研究：基因表达调控，蛋白功能，信号转导和药物筛选研究建立细胞系：转基因细胞模型、永生性细胞株建立转基因动物模型基因治疗研究和应用蛋白功能和定位研究重组蛋白生产及蛋白药物研究目前三页\总数七十三页\编于十九点Whydoweneedtransfectionreagent?DNA:highlyanionicandhydrophilicmacromoleculeNoionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReagentMembrane:anionicandhydrophobic----------HeparanSulfateProteoglycanes目前四页\总数七十三页\编于十九点细胞转染难易比较Adherent>Suspension Problem: E.g.:MembraneTHP1,Jurkat…Fastdividingcell>nondividingcell Problem: E.g.:AccesstothenucleusNeurons,…Cellline>Primarycell Problem: E.g.:MoresensitiveEpithelialprimarycells…体外转染目前五页\总数七十三页\编于十九点PolyPlus-transfection是法国一家专门致力于研发和销售转染试剂的生物技术公司PolyPlus-transfection公司简介

PolyPlus-transfection提供体内和体外转染产品，包括基因、寡核苷酸、siRNA及蛋白转染产品，可进行瞬时和稳定的转染及重组蛋白质制备。目前六页\总数七十三页\编于十九点第一部分产品介绍目前七页\总数七十三页\编于十九点InVitroInVivosiRNAtransfectionStandardtransfectionINTERFERin™jetSI™-ENDOTraffickingandvisualizationjetSI™-FluojetSI™-ENDO-Fluo产品介绍DNAtransfectionStandardtransfection

invivo-jetPEI™Ligand-conjugatedreagents

invivo-jetPEI™-Galinvivo-jetPEI™-ManTraffickingandvisualization

invivo-jetPEI™-Fluoinvivo-jetPEI™-biotinDNAtransfectionInvitroInvivoStandardtransfection

jetPEI™Cell-specifictransfectionjetPEI™-GaljetPEI™-MacrophagejetPEI™-HUVECjetPEI™-RGDTraffickingandvisualization

jetPEI™-FluojetPEI™-biotinSyntheticmediumtransfectionFecturin™ProteindeliveryProteinandantibody

PULSin™invivo-jetPEI™MousebraininjectionjetSI™10mMsiRNAtransfection目前八页\总数七十三页\编于十九点产品系列

Protein&antibody转染

------PULSinSiRNA体外转染

------INTERFERin

DNA&SiRNA体内转染------invivojetPEIDNA体外转染

------invitrojetPEI目前九页\总数七十三页\编于十九点产品系列一Protein&antibody转染:-------PULSin蛋白转染目前十页\总数七十三页\编于十九点Protein&antibody转染应用：细胞内定位研究蛋白水平的干扰研究抗体功能封闭的研究疾病治疗的研究替代免疫细胞化学在活细胞内检测蛋白转染目前十一页\总数七十三页\编于十九点protein转染难题

MassChargePurityStability3DstructureReleaseActivityxkDapI=xx%hoursordaysGlobular,random,well-definedstructureFreeproteinincytoplasmDNAandRNA=anionicpolymersProtein=morecomplexmolecules蛋白转染目前十二页\总数七十三页\编于十九点技术原理PULSin™:

cationicamphiphilic-basedformulation蛋白转染目前十三页\总数七十三页\编于十九点操作步骤21For24-wellplate:细胞融合度：70-80%稀释蛋白：1µgofprotein/100µlHepes1加4µl

PULSin™2孵育15min3洗细胞，加900µl无血清培养基4加protein/PULSin复合物345孵育4h5更换新鲜完全培养基6分析蛋白活性或检测6蛋白转染目前十四页\总数七十三页\编于十九点R-phycoerythrinNIH-3T3cellsConditions:Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy16hourspost-delivery.pI=5.5MW=240kDaPULSin转染蛋白质1µgR-PE + + -

4µlPULSin™

+ - -DiffusefluorescenceEfficientdeliveryofproteinwithPULSin™蛋白转染目前十五页\总数七十三页\编于十九点PULSin™转染单抗HeLacellsanti-NPC-(AF®488)1µlAb4µlPULSin™Conditions:Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy8hourspost-delivery.LocalizedfluorescencearoundnuclearmembraneEfficientdeliveryoffunctionalAb抗体转染目前十六页\总数七十三页\编于十九点PULSin™转染多抗HeLacellsanti-giantin-(AF®488)0.5µlAb4µlPULSin™Conditions:Livingcellswereanalyzedbyconfocalmicroscopy17hourspost-delivery.PlasmamembraneswerestainedwithConcanavalinA-rhodamine.EfficientdeliveryoffunctionalAb抗体转染

目前十七页\总数七十三页\编于十九点PULSin™转染多肽多肽转染HeLacellsConditions:DeliveryofPep-A(StreptococcusTPEBepitope,),intoHeLacells.ComplexeswereformedwithPep-A(1µg,lissamine-rhodaminederivative,Sigma)andPULSin™(4µl).Observationwascarriedout16hpost-delivery.Pep-A(StreptococcusTPEBepitope)16aa，lissamine-rhodaminederivativeEfficientdeliveryofPeptides目前十八页\总数七十三页\编于十九点PULSin™已转染的不同细胞类型R-PE:1µg/PULSin™:4µlDeliverytoawidevarietyofcells蛋白转染目前十九页\总数七十三页\编于十九点PULSin™已转染的细胞及转染效率蛋白转染R-phycoerythrinR-phycoerythrinR-phycoerythrin目前二十页\总数七十三页\编于十九点PULSin™:蛋白/抗体/多肽列表蛋白转染目前二十一页\总数七十三页\编于十九点优势：

新新技术——活细胞中进行Protein/Ab转染高转染效率

无细胞毒性

即用型溶液

操作简单PULSin™优势蛋白转染目前二十二页\总数七十三页\编于十九点PULSin™的竞争对手蛋白转染Chariot

(ActiveMotif)BioPorter(GTS)ProteoJuice(Merck)目前二十三页\总数七十三页\编于十九点产品系列二体外SiRNA转染:-------INTERFERinsiRNA转染目前二十四页\总数七十三页\编于十九点选择、设计、合成siRNA双链化学合成siRNA质粒表达siRNA转染siRNA到靶细胞瞬时表达——化学合成siRNA，质粒表达siRNA稳定表达——质粒表达siRNA分析检测RNA干扰作用蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平:实时定量RT-PCR，northernblottingsiRNA基因沉默实验设计目前二十五页\总数七十三页\编于十九点iRNA介导基因沉默机制

siRNAsiRNAexpressionplasmidCleavagebyDicersiRNAssiRNAassociatewithRISCCleavageofmRNAbyRISCRISCdsRNADicercleavageofdsRNAHairpinsiRNACellmembraneNuclearmembraneProteinXINTERFERin™jetPEI™siRNA转染目前二十六页\总数七十三页\编于十九点实验操作

siRNA(1nM)inserum-freemedium1AddINTERFERin™Vortexandincubate10minatr.t.31234AddtowellcontainingcellsincompletemediumIncubatefor48hoursat37°C56Genesilencingassay6542Protocolforcellsin24-wellplateINTERFERin™siRNA转染目前二十七页\总数七十三页\编于十九点反向操作——HTS操作

StandartprotocolReverseprotocolPlatecells24hpriortotransfectionDilutesiRNAsAddINTERFERin™VortexIncubate10minDistributeintowellsDistributesiRNAsoruselibrariesAddINTERFERin™MixIncubate10minAddcells96-wellplateDay1Day2Day1Day3PlateTransfectAssayPlateandtransfectDay4AssaysiRNA转染目前二十八页\总数七十三页\编于十九点反向转染基因沉默效率

A549-GL3LucLuciferase96-wellplate反向转染仍能得到极高的基因沉默效率siRNA转染目前二十九页\总数七十三页\编于十九点siRNAdeliverywithINTERFERin™

CaSkicells(24-wellplate)LaminA/CImmunofluorescenceassay1nMsiRNAsiRNA转染基因沉默效率目前三十页\总数七十三页\编于十九点基因沉默效率GreatsilencingdowntopicomolarsiRNAconcentration

A549-GL3Luccells(24-wellplate)Luciferase70%92%siRNA转染目前三十一页\总数七十三页\编于十九点细胞毒性

A549-GL3Luc(24-wellplate)1nMsiRNANocellulartoxicityobservedwithINTERFERin™L1INTERFERin™L2siRNA转染目前三十二页\总数七十三页\编于十九点成功转染的细胞系SilencingefficiencywithINTERFERin™invariouscelllinessiRNA转染目前三十三页\总数七十三页\编于十九点原代细胞的高效沉默

24-wellplateGAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)BranchedDNAassay96%人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82%siRNA转染目前三十四页\总数七十三页\编于十九点INTERFERin优势低浓度siRNA（甚至pmol级别）就能达到高效的基因沉默在很多细胞系中，基因沉默效率可达到90％以上在原代细胞中也能达到有效的基因沉默效率无细胞毒性不受血清和抗生素的影响操作简单价格便宜在反向操作转染中的效率高siRNA转染目前三十五页\总数七十三页\编于十九点siRNA转染竞争对手Lipofectamine2000（Invitrogen）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）SiLentFect（BioRad）

Invitrogenisthelargest

siRNAtransfectionmarketQiagenisadangerousoutsiderwithHiPerFectsiRNA转染目前三十六页\总数七十三页\编于十九点INTERFERinvsLipofectamine2000目前三十七页\总数七十三页\编于十九点INTERFERin

vs

Oligofectamine目前三十八页\总数七十三页\编于十九点INTERFERin

vsHiPerFect/SiLentFect目前三十九页\总数七十三页\编于十九点INTERFERin™与HiPerFect/SiLentFect

基因沉默效率

A549-GL3Luc(24-wellplate)Luciferase目前四十页\总数七十三页\编于十九点INTERFERin™与HiPerFect/SiLentFect

细胞毒性

A549-GL3Luc(24-wellplate)1nMsiRNANocellulartoxicityobservedwithINTERFERin™HiPerFectINTERFERin™SiLentFect™目前四十一页\总数七十三页\编于十九点体内DNA&siRNA转染:

------invivojetPEI产品系列三体内转染目前四十二页\总数七十三页\编于十九点invivojetPEI

vs

VirusesinvivojetPEI:easytobeusednotimmunogenicnottoxiccandeliveredoligonucleotidesuptoverylargeDNA… …butalsosiRNA体内转染目前四十三页\总数七十三页\编于十九点Efficiency/specificity++++++++++Virusin

vivo-jetPEI™genesize(kbp)3-30>400YesnoneImmuneresponseYes(L2–L3)noneLabrequirement体内转染invivojetPEIvsViruses目前四十四页\总数七十三页\编于十九点DifferentroutesVariousanimals

Intravenous静脉Intratumoral瘤内Intracerebral脑室Intraperitonal腹膜Intratracheal气管灌注Instillation…吸入MouseRatDuckGuineapigMonkey…体内转染的路径和动物…towardsHumanapplication体内转染目前四十五页\总数七十三页\编于十九点体内转染的基因表达分布情况O.Freund活小鼠体内荧光素酶表达的荧光检测图象（用含50µgpCMVluc和invivo-jetPEI复合物的400µl5%葡萄糖溶液尾部注射Balb/Cmice）

Liver30000Tumor2000KidneyL300000LungR20000000KidneyR115000OvaryL210000LungL16000000OvaryR150000CourtesyJL.CollandO.Freundinvivo-jetPEI体内转染体内转染目前四十六页\总数七十三页\编于十九点InRatsH19-DTA（H19-白喉毒素A基因）质粒与invivo-jetPEI复合物转入大鼠膀胱。

NBT-IIcells 50µgDNAatD+4&D+8 D+11ratsweresacrified

Ohana,P.,etal.GeneTherMolBiol(2004)8,181-192DecreaseinbladderweightInhibitionoftumorgrowthinvivo-jetPEI转染对膀胱癌的治疗体内转染目前四十七页\总数七十三页\编于十九点InHumanH19-DTAplasmid/invivo-jetPEI™复合物转染对人膀胱癌的治疗Ohana,P.,etal.GeneTherMolBiol(2004)8,181-192(D)Video-cystoscopyperformedbeforethetreatmentandthreeweeksafterthecompletionofthe6thtreatment,showingalargenecroticareareplacingthetumorregion(E).Treatmentshows>75%tumorregressioninvivo-jetPEI转染对膀胱癌的治疗体内转染目前四十八页\总数七十三页\编于十九点活体小鼠尾静脉注射（24小时后的荧光检测图）24hourslater,theluciferasegeneexpressionwasmonitoredbybioluminescentimagingoflivemiceusingacooledCCDcamera.DNAalone(GL2-Luc)DNA(GL2-Luc)+GL2-Luc-siRNA,10µgDNA(GL2-Luc)+GL3-Luc-siRNA,10µgColl,Freund,Erbacherinvivo-jetPEI:DNA-siRNA共转染siRNAandpCMVLuc与invivo-jetPEI复合物转染对荧光素酶肺部表达起明显的抑制作用。体内转染目前四十九页\总数七十三页\编于十九点Urban-kleinetal.,GeneTherapy,1-6,2004C-erb2/neu(HER-2)receptorinvivo-jetPEI：--体内基因沉默HER-2downregulationTumorgrowthinhibitionduring18daysi.p.inathymicnudemiceSubcutaneoustumorxenograftsSKOV-3(ovariancarcinomacell)A)NakedHER-2specificsiRNA(0.6nmole)B)HER-2siRNA/PEIpolyplexes体内转染目前五十页\总数七十三页\编于十九点产品系列四DNAinvitro

transfection:

------invitrojetPEI体外DNA转染目前五十一页\总数七十三页\编于十九点DNA转染过程体外DNA转染提取质粒DNA或寡核苷酸选择和培养细胞系转染瞬时转染稳定转染：抗性筛选检测外源基因细胞内表达的实验流程：目前五十二页\总数七十三页\编于十九点DNA转染试剂+H3NO+ONH3CCH3H3CDOTMA(Lipofectin®)MonocationiclipidsPolycationiclipids++NONOHNHNH3H2NTransfectam™CationicpolymersPAMAMDendrimerOHONHONHOH2NNHRNHRNHRnPolylysineandderivativesNNNNNNNNNNH2NNH2NH2NH2NH2NH2NH2H2NH2NH2NH2NNH2012GenerationsNHNNHNHNNHNNHNHNHNNH3+NHNHNNHNHNNNHNH2NH+3HN+3HNNH3+NH3+NH3+Polyethylenimine(PEI)体外DNA转染目前五十三页\总数七十三页\编于十九点polyethylenimine(PEI)NH=-CH2-CH2-NH-=43DaammoniumgroupsforDNAcondensationbufferingaminegroupsbranchedPEIlinearPEI1H+/amine3579pH0.5nnjetPEI™体外DNA转染目前五十四页\总数七十三页\编于十九点DNAjetPEICationiccomplexesnucleusProtonSpongecytoplasmEndocytosisinvitroDNAdelivery体外DNA转染NHHNOHnmHCl-H3C目前五十五页\总数七十三页\编于十九点jetPEI1µl=7.5nmolesofaminefunctionDNA1µg=3nmolesofphosphategroupnumber

of

nitrogen

residues

of

jetPEInumber

of

DNA

phosphates=NPComplexesFormation2µlofjetPEIfor1µgofDNAatN/P=5InvitroDNAdelivery目前五十六页\总数七十三页\编于十九点jetPEI™:实验操作+serum2µlofjetPEIfor1µgofDNA1mlofjetPEI=500transfectionsin24-wellplates or=2500transfectionsin96-wellplates体外DNA转染目前五十七页\总数七十三页\编于十九点HeLacells1µgofpCMVLuc,N/P5ComplexesFormationEffectofincubationtimeSameefficiency体外DNA转染目前五十八页\总数七十三页\编于十九点HeLaHEK293NIH3T3ß-galactosidaseBHKN/P=3N/P=5controlpCMVLacZReproductibilityCellstransfectedin24-wellplateswithjetPEI(N/P=5)withaß-galactosidase-expressingplasmid(pCMVLacZ).ExpressionwasvisualizedbyX-galstainingafter24h.

60–80%60–80%40–60%jetPEI:转染效率体外DNA转染目前五十九页\总数七十三页\编于十九点细胞特异性jetPEI转染产品jetPEI-Macrophage（巨噬细胞） jetPEI-Mannose/Mannosereceptor/MacrophagesjetPEI-Hepatocyte（肝实质细胞） jetPEI-Galactose/Galactose