生命科学研究热点干细胞

举例说明细胞增殖调控与肿瘤发生的关细胞周期调控检验 细胞周期(cellcycle)是细胞生命活动的基本过程,指从细胞结束开始到下一次细胞分裂结束为止的过程。在细胞周期过程中,细胞内存在一系列的调控机制,以确保细胞周期严格时相转换依次有序进行。已发现的与细胞周期调控有关的分子很多,包括细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶cyclindependentkinaseCDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKinhibitor,CKI)。细胞周期调控是一个复杂的生物学过程,这一过程涉及到很多原癌、抑癌的生物学因子,它们在因素作用下可发生突变、缺失、异位、扩增等变化,导致细胞周期的失控,进而异常细胞无限增殖,形成肿瘤。近年来,随着分子生物学技术的发展,研究人员发现,控制细胞增殖的关卡检验点(checkpoint)在肿瘤细胞和正常细胞中存在差异,包括原癌、抑癌及胞周期蛋白在内的细胞周期调控分子在发生、发展过程中均起着重要作用,逐步深入的1cyclinscyclinD是原癌，cyclinD主要在G1期起调控作用,被看做是生长因子感受器,其表达对生长因子有明显的依赖性。在G1期早期,D型周期蛋白开始表达,并与CDK4或CDK6等多种激酶结合,促使RB的磷酸化,释放E2F,促进多种的表达,在细胞进入G1cyclinD的表达,S期。当细胞周期通过G1期后,cyclinD开始降解。当cyclinD1变异时,cyclinD1会出现过度表达,使细胞过度增生,产生肿瘤。CKI是cyclin-CDK复合体,起负性调控作用的因子,可细胞通过检验点,具有抑癌的活性,目前已发现7种CKIs,依其构效性质可分为INK4和CIP/KIP两大:INK4(inhibitorofCDK4),又称p16,包括p15、p16、p18、p19,它们同CDK4CDK6结合,能够特异性抑制cyclinDCDK4、cyclinD1CDK6CIPKIP家族,又称p21,包括p21、p27、p57等,能广谱抑制cyclin-CDK的作用。p16定位于9p21,主要作用是抑制CDK4/6介导的RB的磷酸化,细胞从G1期进入S期。的点突变和甲基化修饰均可导致p16的失活,进而导致细胞的过度p21p53的下游调控因子,p53p21蛋白的异常表达在肿瘤发生发展中起重要作用,见于多种人类。p21蛋白为野生型p53下游激活产物,是人们发现最早的CKIp21cyclins、CDKPCNADNA损伤和细胞衰老时,p53p21转录,p21cyclin-CDK复合物结合,抑制其蛋白激酶的激活,p53是研究最为广泛、深入的肿瘤。它属于抑癌。p53是细胞周期由期进入S期的控制站,通过其下游的p21抑制CDK完成G1阻滞,在DNA前启动对损坏DNA的修复,未能对DNA进行精确性的修复将会导致p53依赖性细胞凋亡。G1/S检验点：DNA是否损伤，细胞外环境是否适宜，细胞体积是否足够大。RG1细胞能够顺利进入S，R越过RS期检验点：DNA是否完成。DNA损伤检查点可以在DNA受损时的启动或终止，为DNA修复赢得时间。机制：P53依赖途径和非P53依赖途径（P53：多功能转录因子，可以激活Cdk抑制因子P21的表达，还可以诱导细胞凋亡。正常情况下P53很短，活性很低，这是因为大多数P53被Mdm2带出细胞核被降解，但在DNAATM/ARTMdm2P53P53P21Cdk，G1）G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点所有DNA是否都正确，DNA是否有损细胞体积是否足够大。DNA检验点可检测DNA是否完整，以及是否被多次。DNA检验点持续作用于S期和G2期，使Cdk1保持磷酸化，不能启动M期。DNA损伤严重时，DNA检验点将启动细胞凋亡检验点)是一种进化上高度保守的机制，它保证中期在赤道面上完全排列整齐之前染色单体不会比吃分离，从而保证细胞周期蛋白异常：cyclin突变、重排，是这些cyclin异常表达，从而使细胞通过期，进入S期，细胞即自发增值，在许多人类肿瘤中，均发现cyclin扩增CDK和CDKI突变：研究中发现肿瘤细胞CDK的水平一般较高，而CKI常见缺CKICKICDK功能。抑癌突变：不少癌细胞中发现Rb或P53发生了突变，使Rb失去了阻断mRNA转录，P53失去了式细胞株休止在G1后期的功能，造成细胞周期失控。细胞周期与肿瘤的治疗G1cyclin的过度表达（RNA干扰促使肿瘤细胞表达正常的CKIs（有用正常的P16P21P27与腺载体重组，再将重组的腺导入肿瘤细胞重组的腺在肿瘤细胞内表达有功能的P16P21P27蛋白，CDKs的活性，抑制肿瘤细胞增殖）定义分类特点分化机制应用价值能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）和成体干细胞（somaticstemcell。根据干细胞的发育潜能分为三cellTSCcell（（（ＮＳＣ干细胞特征干细胞具有正常、完整及稳定的核型干细胞分化的实质是通过组合调控实现组织特异性选择性表ESC定向分化的机制，ES细胞分化实质是胚胎发育过程中特异蛋白质的合成。而任何特异蛋白质都是由它相对应的差异表达是在发育中按着一定程序，有选择地相继活化的现象。奢侈对细原蛋白等o，调节差异表达的物质存在于细胞质中o每个子细胞所继承细胞质的差异决定了各子细②细胞与决ESC在体外分化，但还没有一种生长因子能诱导人ESC定向分化为一种特定细胞，生长因子ESC诱导方法o在发育学方面研究比较深入的诱导因子主要有维甲酸（RA）\MPs）\成纤维细胞生长因子(FGFs）等。RA可以通过经典的信号转导途径诱导ESC分化，还可以抑制LIMPs是转化生长因子p(TGF-p）超成员中最大的一族9BMPs可通过促原活化蛋白激活通路(MAPK）ESC向心脏的分化o受生长因子诱导ESC分化的启发人们开始尝试利用转方法达到诱导ESC定向分化而 方法具有更大的应用前景主要是利 分化在ESC中过表达从而调节ESC的分化与添加FGF-2因子相比较利用单纯疱疹作为载体将FGF-2转入ESC中诱导产生的神经细胞是前者的3倍Kauf-man等[5]ESS17C166共培养,可促进人干细胞分化中表达的调节组合调控调节组织特异性表2006Yamanaka等首次获得小鼠诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)，由此将iPSCs技术推向了生物医学的前沿。iPSCs技术更被誉为继克隆技术、胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)技术之后干细胞领域的第三。由于规避了ESCs异体移植免疫排斥的风险以及ESCs来源的等，在再生医学领域展现出广阔的应用前在获得iPSCs时转录因子的转化效率较低，且存在潜在的性等问题，引起了学术界的（一）iPSCs过程中导入一些小分子化合物不但可促进细胞重编程，甚至可取代某些转录因子的作用。aenisch等(2008)Wnt3a亦可替代原癌基取代插入组后可能引起突变的内源性，将是提高iPSCs安全性的有效途径之一。MEFM1。简化诱导步骤使得MEF，使其成为可长期自我更新的蛋白诱导多能干细胞，从而取代诱导。Kim等首先将这项技术应用于细胞，诱导出人iPSCs的生成率，技术上有待进一步改进。RNA诱导多能干细胞：piPSCs为研究者们开辟了新思路，要解决蛋白质直接导人细mRNA、miRNAsiR．NA具有不会插入哺乳动物人人皮肤细胞，得到核糖核酸诱导多能干细胞(RNA．inducedpluripotentstemcells，RiPSCs)MJ100倍以研究小组利用siRNA干扰抑癌p53，显著提高了重编程的效率（二）iPSCs研究的另一热点。为此，Mostoslavsky等首次完成了仅用1个载体同时表达4种转录因子的实验，减少了体。Yamanaka等(2008)用两个质粒反复MEF获得iPSCs。但由于此法需要质粒的多次（三）iPSCsiPSCs生命最大的奥秘便是人是如何从一个细胞发展为复杂得不可思议的生物体的人胚胎细胞系的建立及人胚胎干细胞研究可以帮助我们理解人类发育过程中的复杂使人深刻认识数十年来困扰着胚胎学家的一些基本问题促进对人胚胎发育细节的基础研究人胚胎干细胞的体外可操作性可以一种 上可接受的方式，提供在细胞和分子水平上研究 发育过程中极早期 的方法这种研究不会引起与实验相关联的 问题因为仅靠自身胚胎干细胞是无法形成胚胎的。细胞替代治疗和 过的细胞直接移植或输入体内，达到控制和治愈疾病的目的。这种遗传改造包括纠正体内存在的突变或使所需信息传递到某些特定类型。当然，干细胞技术的最理想阶段是希望在体行“克隆”以供移植。如果这一设想能够实现，将是人类医学中一项划时代的成就，它将使培养工业化，解决供体来源不足的问题；使供应专一化，提供特异性。学家Bjorklund及其同事已经应用从脑中分离的神经组织细胞移植人诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPS24ES（转录因子，将它们全部转入体细胞（成纤维细胞）iPS少转入因子的个数，最终确定了必须将以上四个因子同时转入才能成功。他于2006年利用载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的组合转（ES的一种细胞类型。转入的方法可以是通过逆转录或腺载体或质粒（但质粒效果不理想。iPS理就是把山中将四个在胚胎干细胞中高表达的Oct4,Klf4,MycSox2Ips研究意义ips可望制造特定的ips细胞，用个性化移植来治疗诸多疾Ibs存在的问题肿瘤相 的使用如c-myc的使用，有诱发的可 Ibs的表达模式与ESC还与一些不DNARNADNA-DNADNA-RNARNA-RNA实验方标记探针的准备cDNA、RNAcDNARNAmRNAmRNARNA组织样品光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚常规石蜡包埋和切片但在操作过程中应RNA酶污染电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在 包埋的组织切片上进行，称包埋前技术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较差。杂交杂交体探测根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学基本实验过探针标记→纯化→(变性 →金银样品→切片→通透处①细胞特异性mRNA转录的定位，可用 图谱 表达 组进化的 DNA/RNA的检测和定位，如EBmRNA、人类状瘤和巨细 在转录水 2008年化学奖下村修：于1962年在水母Aequoreavictoria发现并GFP，马丁·查：证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值，这一GFP结构特点GFP238个氨基酸残基组成,分子量为26.9kD.GFP的第65、66、67GFP一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置,生色团附着在α螺旋上.GFP的最大吸收峰395nm(紫外)GFP的应用：蛋白质定位，作为报告，药物筛选，融合抗体，生物传感GFP融合蛋白的构将目的与GFP构成融合通过愈伤组织转化法枪显微注射、 定位。将目的与gfp 融合有以下几种方式:将gfp置于目的后面，即目的-gfp或将gfp置于目的前面，即gfp-目的。注意事项两 之间用Linker连接在两个交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数)，如增加几个为甘氨酸或赖小，有利于GFP发光。前一必须要有起始，而不能带有终止；后一要保证有终止。以gfp作为报告研究蛋白亚细胞定位，必须做对照。由于某些细胞本身也有自发荧光，必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光，以实验步骤从含GFP的载体上酶切下GFP，比如pGFP载体，切胶回收GFP片肠杆菌菌株，比如BL21。如果是想在植物细胞或动物细胞里表达，利用菌落PCR免疫荧光实验基本实验步骤PBSPBS（1000rpm,5min2胞离心甩片机细胞片或直接细胞涂片。PBS4℃3PBS3×5min.5-15min.PBS3×5min.1h4℃过夜。PBST31h.PBST35minRNARNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性沉默。它是真核生 转录后沉默作用的重要机制之一RNAi技术作为新兴的阻抑方法， 组学、微生物学、表达调控机理研究等领域得到了广泛应用（一）RNAi作用机通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs，siRNAs)。表明;一个称为Dicer的酶，是RNaseIII中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转等各种方式引入的RNA，RNA19-21bpRNAs(siRNAs3’RISCRISCATPRNARISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切mRNARISCsiRNA和一基化，从而使启动子失去功能，使其下游沉默。（二 简要流程BglIIXhoI（pRI染、脂转染、电穿孔转染等）GFP（GFP3-5）检测目标蛋白或mRNA表达水平（您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下蛋白的表达变化与mRNA水平的表达变化一致为检测蛋白表达情况您可以使用Western-Blot为检测mRNA表达情况，您可以使用逆转录+RealtimePCRNorthern-Blot）2014奖生理学或医学奖得主为科学家JohnO'Keefe(-)，挪威科学家MayBrittMoser(梅-布莱特-莫索尔)；以及挪威科学家EdvandMoser(-莫索尔)，以他们在我们如何知道自己的位置？我们如何从一个地方去到另一个地方？为何当我们的生理学与医学奖获得者们发现了大脑内的一种大脑中内置的“GPS”，它让我们能够在空间中行实现定位，揭示了高等认知能力的细胞层面机制。1971年，·奥基夫(JohnO´Keefe)发现了构成这一体系的第一个组成部30多年后，在2005年，May-BrittMoser和Edvard