引物设计说明

引物设计说明(2009-05-1309:35:28)转载戏标签：杂谈引物设计步骤：1.查阅自己所需要基因的研究状况。用将各个相近或相关物种的氨基酸序列进行比对www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.hteml书写格式例如：>portunus(物种名，只是一个标志)MVSRAHSRFSCQRTTLLAVVLLAVLWSSSLQQAAARVINDDCPNLMGNRDLYKKVEWICDDCANIYRSTGMASLCRKDCFFNEDFLWCVRATERSEDMMQLKQWVRILGAGRI>CamMMSRANSRFSCQRTWLLSVVVLAALWSFGVHRAAARVINDECPNLIGNRDLYKKVEWICEDCSNIFRKTGMASLCRRNCFFNEDFVWCVHATERSEELRDLEEWVGILGAGRD>CasMMSLAHSKFSCQRTRLLAVVLLAALWSSSLQQAAARVINDDCPNLIGNRDLYKKVEWICDDCANIYRSTGMASLCRKDCFFNEDFLWCVRATERSEDLAQLKQWVTILGAGRI>CapMMSRTESRYSSQRTWLLSMVVLAALWSISVQRATARVINDDCPNLIGNRDLYKKVEWICEDCSNIFRNTGMATLCRKNCFFNEDFLWCVYATERTEEMSQLRQWVGILGAGRE>ChfMMSRANSRFSCQRTWLLAVVVLAAIWSSSLHQAAARVFNDDCPNLMGNRDLYKKVEWICDDCANIFRIPGMASICRKDCFFNEDFLWCVRATERTEEMMQLKQWVRILGAGRM>MeeAMYRMPMRFWLTAVVMVVVGALLLDTASASYIENTCRGVMGNRDIYKKVVRVCEDCTNIFRLPGLDGMCRDRCFNNEWFLVCLKAANRDDELDKFKVWISILNPGL>liv1MYRLAMKTWLAIVIVVVGTSLFFDTTSASFIDGTCRGVMGNRDIYKKVVRVCEDCTNIFRLPGLDGMCRDRCFYNEWFLICLKAANREDEIEKFKVWISILNAGQ（碱基比对同理）根据比对结果，找出保守氨基酸即功能氨基酸的位置。然后进一步确定碱基在总cDNA中的位置。确定正向引物和反向引物的位置。应该尽可能包括所有的保守序列。利用Primer5.o确定合适的引物位置。送引物，引物书写均为5-3,运用/可以将碱基序列翻译为氨基酸序列进行比对确认。1.送引物，引物书写均为5-3,运用/可以将碱基序列翻译为氨基酸序列进行比对确认。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54°C的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18〜24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其AG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。引物GC含量和Tm值PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56〜62C范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2〜3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。引物的3’末端核苷酸组成引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的AG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T,G或C错配仍可有效延伸。PCR产物的长度及在耙序列内的位置所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120〜300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250〜750bp范围内。补充说明若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA有同