间接免疫荧光实验

间接免疫荧光实验第1页，共13页，2023年，2月20日，星期四实验原理固定在载片上的灵长类肝组织和HEp-2细胞与适当稀释的待检血清反应后,如果待检血清中有ANA,就会与细胞核成分特异结合,加入FITC标记的的羊抗人IgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。第2页，共13页，2023年，2月20日，星期四试剂与器材1.抗原片2.荧光标记的二抗3.PBS-Tween缓冲液4.阴、阳性参考血清5.封片介质:磷酸盐缓冲甘油6.盖玻片7.器材:荧光显微镜、摇床、脱色缸、吸管、试管等第3页，共13页，2023年，2月20日，星期四生物薄片生物薄片马赛克：将包被有不同基质的生物薄片固定在一个载片反应区中，可同时检测多种抗不同组织或病原体的抗体。第4页，共13页，2023年，2月20日，星期四滴定平板技术：使实验操作标准化

将标本或试剂滴加到加样板反应区上，然后把生物薄片载片盖在加样板的凹槽里，所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始.系统的几何结构决定了液滴的位置和高度.第5页，共13页，2023年，2月20日，星期四荧光二抗荧光素发射的荧光色激发波长（nm）发射波长（nm）异硫氰酸荧光素（FITC）

绿495528荧光素及其激发波长和发射波长第6页，共13页，2023年，2月20日，星期四荧光显微镜：

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落射式荧光显微镜①不需要额外的聚光镜②可产生高对比度的暗视野③同时进行明视野、暗视野的抗原基质定位④可观察两种不同的荧光⑤可改变荧光的强度第7页，共13页，2023年，2月20日，星期四IIF操作步骤１．准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。注意不要触及生物薄片。用笔编号、标记。２．稀释：用磷酸盐缓冲液1:100稀释血清。注意：阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀３．加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。４．第一次温育：将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30分钟。５．清洗：用磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的脱色缸中浸洗5分钟。第8页，共13页，2023年，2月20日，星期四６．加样：滴加20ulFITC标记的羊抗人IgG至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。注意：标记的IgG使用前需混匀。７．第二次温育：从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，注意避免阳光直射载片。８．清洗：同上。９．封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加10ul封片介质至盖玻片每一反应区。从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。１０．结果判断：荧光显微镜下观察特异的荧光模型。第9页，共13页，2023年，2月20日，星期四以HEp-2细胞为基质检测ANA免疫荧光模式均质型

颗粒型核仁型核膜型第10页，共13页，2023年，2月20日，星期四实验报告阴性：检测系统正常，待测标本在合适的起始稀释度下，实验基质没有明显的荧光染色（与阴性对照在同一水平），或没有可以辨认的荧光模式

阳性：检测系统正常，待检标本在合适的起始稀释度下，产生明显高于阴性对照的特异荧光，且有明显可以辨认的荧光模式

免疫荧光模式：阳性结果应报告

滴度：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到特异性荧光反应的最高稀释度，报告滴度利于病情监测第11页，共13页，2023年，2月20日，星期四阳性标本经系列稀释后可测出其滴度。最适稀释因子为3.162（10的平方根），这样，每隔一步就出现一个10的整数倍数（1:10、1:32、1:100、