实验四、PCR产物的T载体克隆和转化

医用分子生物学实验技术青海大学医学硕士研究生课程重组DNA技术操作步骤基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

主要步骤：①制备目的基因和选择相关载体②目的基因和有关载体进行连接③重组的DNA导入受体细胞④DNA重组体的筛选和鉴定⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究

以质粒为载体的DNA

克隆过程

（三）PCR扩增特定基因

（四）人工合成一、目的基因的获得——分

（一）从基因组文库中获得

（二）从cDNA文库中获得组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。几种常用克隆载体的比较注：+表示可用；-表示不可用比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因组DNA文库-++-cDNA文库++--亚克隆+--+序列分析++-+E.coli表达++--二、载体的选择与准备——选三、DNA分子的体外连接——接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接（一）黏性末端（二）人工接头（三）加入同聚体尾待克隆DNA片段重组质粒混合、退火空白质粒（四）平端连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´3´5´四、外源DNA导入宿主细胞——转受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)

外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。五、目的基因的筛选和鉴定——筛1.借助载体上的遗传标志进行筛选

(1)利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选2.序列特异性筛选

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸杂交法(4)DNA测序法

（一）

遗传学方法

1.插入灭活法插入失活筛选带有重组载体的克隆2.蓝-白筛选（α互补）

许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。α互补筛选（蓝-白筛选）PCR产物的T载体

克隆和转化

实验目的：

学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求：

掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。技术应用：

目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。实验四、PCR产物的T载体克隆和转化材料：目的基因片段（回收的PCR产物）药品：pEMGT-Vector(Promega公司)实验四、PCR产物的T载体克隆和转化

质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA

分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。实验四、PCR产物的T载体克隆和转化质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体

允许外源DNA的插入、储存和表达。实验四、PCR产物的T载体克隆和转化实验四、PCR产物的T载体克隆和转化实验原理普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A；T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。实验四、PCR产物的T载体克隆和转化载体结构的三大要素：

多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位实验四、PCR产物的T载体克隆和转化pGEM-T载体的结构实验四、PCR产物的T载体克隆和转化pGEM-TEasy载体的结构实验四、PCR产物的T载体克隆和转化实验步骤（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：实验四、PCR产物的T载体克隆和转化(2)连接实验：在0.2mlPCR管加入以下试剂：目的片段（100ng/ul）3μl

pGEM-TEasy（50ng/ul）1μlT4DNALigase1μl2×RapidLigationBuffer5μlTotal10μL备注：混合均匀，瞬时离心。4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。实验四、PCR产物的T载体克隆和转化说明1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增