生物技术教学大纲

生物技术教学大纲生物技术实验BiotechnologyExperiment一、课程性质和任务生物技术实验是基础医学实验教学的重要组成部分，内容涵盖分子生物学、生物化学、医学遗传学、细胞生物学、医学免疫学等学科领域中常用的基本操作技术。现代医学的高速发展，要求学生不仅要有较高的理论水平，还要有较强的科研能力。通过生物技术实验教学，使学生掌握了蛋白质分离纯化与含量测定、核酸提取分离纯化与含量测定、分子杂交、基因扩增、细胞培养与传代等技术原理和基本操作。培养学生科研工作的基本能力、从事科学研究的意识和严谨的科学态度，提高学生实验动手能力和解决问题的能力。同时以科研促进教学，将科研方面取得的、成熟的新实验技术引入学生实验教学中，进一步增强学生的实验技能，提高学生实践能力、思维能力和创新能力。二、基本内容和要求1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质基本内容：聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），然后再进行电泳分离。基本要求：掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。2、葡聚糖凝胶层析分离蛋白质基本内容：凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部（阻滞作用小）而沿凝胶颗粒间隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部（阻滞作用大），流程长，流速缓慢，最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。基本要求：掌握葡聚糖凝胶层析分离蛋白质的方法，了解核酸—蛋白检测仪及部分收集器的工作原理和使用。3、动物组织细胞内DNA的分离和含量测定基本内容：用适当方法将细胞破碎，使DNA处于易被抽提的状态，从脂类、蛋白质等物质中将DNA分离出来并去除RNA。DNA碱基中含有的共轭双键对紫外光有强烈的吸收，用波长260nm紫外光与标准DNA比色测定，即可求出样品中DNA的含量。基本要求：熟悉从新鲜动物组织中分离DNA的方法，掌握用紫外分光光度法测定DNA含量。4、酵母蔗糖酶米氏常数（Km）的测定基本内容：蔗糖酶在pH5.0缓冲液中与不同浓度的蔗糖混合，恒温培养，经过规定时间生成一定数量的还原糖。还原糖在碱性溶液中与硫酸铜共热使二价铜（Cu2+）还原生成氧化亚铜，氧化亚铜再使磷钼酸还原成钼蓝，用分光光度法测定钼蓝，并进而判定还原糖的生成量，以此代表反应开始阶段的初速度（V）然后以不同底物浓度的倒数按林—贝氏作图法，从横轴上截距求出Km值。基本要求：了解底物浓度对反应速度的影响及Km值的意义，掌握蔗糖酶Km的测定方法。5、Vc的性质、含量测定生物技术教学大纲全文共4页，当前为第1页。基本内容：还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯酚靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。生物技术教学大纲全文共4页，当前为第1页。基本要求：了解维生素C的主要性质，学会测定蔬菜和水果中维生素C含量的方法。6、Lowry氏法测定蛋白质含量基本内容：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。在500nm处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。基本要求：学习Lowry氏法测定蛋白质的原理和方法，掌握分光光度法。基本要求：了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响，学习酶活性的判定。7、人类非显带染色体核型分析基本内容：利用显微照相装置拍摄人类非显带染色体的图像，并且将其放大成染色体照片;然后根据国际上统一的标准，按染色体的长短、着丝粒的位置、随体的有无等指标，将人类的46条染色体分成7个组并编上号,最后再将染色体剪贴到专门的实验报告单上，从而制成染色体核型(karyotype)图，并检查正常与否。这个过程就称为核型分析。利用核型分析可以检查人体的染色体数目是否正常，并可发现较大的染色体畸变以及判定性别等。基本要求：熟悉正常人类染色体的数目及形态特征，掌握非显带染色体的核型分析方法。8、X染色质制备与观察基本内容：正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深的椭圆形小体，即X染色质。通过采取口腔黏膜细胞作为检查材料，经染色后可进行观察。基本要求：熟悉X染色质标本的制作方法，掌握细胞核染色方法。9、小鼠骨髓染色体制作及观察基本内容：小鼠骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。基本要求：掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程、原理。10、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳基本内容：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在体外模拟DNA的复制过程，经过变性、复性、延伸三个过程，在一对附加的引物之间诱发聚合反应，短时间内可将要研究的目的DNA扩增数百万倍。基本要求：了解PCR技术的原理，掌握PCR技术的程序和步骤。11、扩散反应基本内容：用一定浓度的琼脂制成凝胶后，其内部形成一种多孔的网状结构，可允许大分子物质通过。可溶性抗原与抗体在琼脂糖凝胶自由扩散后形成沉淀。基本要求：掌握抗原抗体定性沉淀反应原理，了解IgG等免疫球蛋白的定量检测技术。12、对流免疫电泳基本内容：对流免疫电泳是双向琼脂扩散和电泳技术相结合的实验技术。抗原在碱性缓冲液中带负电，向正极移动；抗体蛋白质较大，负电荷少，借电渗作用缓慢移向负极，在适当的条件下，可形成抗原抗体反应而出现沉淀。基本要求：掌握抗原抗体在电场中的反应条件；熟悉对流免疫基本技术。13、血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集生物技术教学大纲全文共4页，当前为第2页。基本内容：用胶体金标记技术，检测尿中有无HCG。首先将鼠抗人HCG的单克隆抗体（一抗）吸附在胶体金颗粒上（胶体金呈紫红色散在颗粒状，肉眼可见）并松弛地附着在A处。鼠抗人HCG（一抗）及兔抗鼠Ig（二抗）分别吸附在检测线B处及阳性对照线（C处）的硝酸纤维膜上。当尿液通过毛细作用上行时，尿中的HCG与A处的抗HCG胶体金结合，并且HCG—抗HCG—胶体金继续上行至检测线B处，并与B处的抗HCG发生反应，形成双抗体夹心免疫复合物，抗体Fc段标有胶体金，即成清晰的紫红色。生物技术教学大纲全文共4页，当前为第2页。基本要求：通过检测尿中有无HCG，掌握胶体金技术的原理。14、免疫荧光实验基本内容：根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，与相应的抗原或抗体起反应，从而使形成的抗原抗体复合物携带上一定量的荧光素，利用荧光显微镜可看出发出荧光的抗原抗体的结合物。基本要求：了解免疫荧光实验的基本原理，掌握荧光免疫基本实验技术。15、淋巴细胞转换实验基本内容：正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中受到有丝分裂原刺激，可转化为淋巴母细胞。目前最常用植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率，从而判定其细胞免疫功能。细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或某些其他疾病时，转化率显然降低。称为淋巴细胞转化实验。基本要求：了解有丝分裂原刺激淋巴细胞转化活性，掌握淋巴细胞分离与培养技术，熟悉淋巴细胞的转化率计算。16、ELISA法检测白细胞介素2基本内容：IL-2主要是由活化的T细胞产生，在机体的免疫应答中发挥主要作用。它有较强的自分泌性和旁分泌性，能促进T细胞NK细胞增殖及活化、诱导LAK和TIL细胞的产生，参与B细胞增殖及活化等作用。IL-2产生水平反映了T细胞的功能。本试验是采用两株识别不同表位的抗IL-2mAb，其中一株作为包被抗体，以识别和结合待检标本中的IL-2，另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体上的IL-2的另一表位结合，并催化底物呈色。基本要求：掌握用酶联免疫吸附的方法检验可溶性抗原分子的技术，了解细胞因子的检测手段。17、小鼠巨噬细胞吞噬实验基本内容：吞噬细胞分小吞噬细胞、大吞噬细胞。前者为外周血中的中性粒细胞，后者包括外周血的单核细胞和组织中的巨噬细胞。检测其功能，有助于疾病的诊断和判断机体非特异性免疫水平。基本要求：掌握大吞噬细胞吞噬功能检测方法，熟悉机体非特异免疫功能。生物技术教学大纲全文共4页，当前为第3页。三、学时分配：生物技术教学大纲全文共4页，当前为第3页。序号内容实验学时1聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质82葡聚糖凝胶层析分离蛋白质83动物组织细胞内DNA的分离和含量测定44酵母蔗糖酶米氏常数（Km）的测定45Vc的性质、含量测定46Lowry氏法测蛋白质含量47人类非显带染色体核型分析48X染色质制备与观察49小鼠骨髓染色体制作及观察410PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测411单双扩散212对流免疫电泳213血型测定和免疫妊娠胶体金间接凝集414免疫荧光实验415淋巴细胞转换实验41