免疫组化技术

病理检验技术

免疫组化技术免疫组织化学技术是在常规HE染色和组织化学染色的基础上，根据抗原抗体反应原理而发展起来的染色技术，广泛应用于病理学研究和临床病理诊断，是临床病理诊断中重要的辅助技术之一，对于判断肿瘤的来源、分类、预后和鉴别诊断以及指导和评估临床治疗起着重要作用。免疫组织化学技术是利用免疫学抗原抗体反应的原理,用标记的特异性抗体(或抗原)对组织细胞内相应的抗原(或抗体)进行检测的一种技术,借助光学显微镜(免疫酶组织化学技术)、荧光显微镜(免疫荧光组织化学技术)和电子显微镜(免疫电镜技术)可观察组织细胞内标记物显示出的特异性的抗原-抗体结合物即阳性反应。在临床病理诊断中应用的免疫组织化学技术主要是免疫酶组织化学技术和免疫荧光组织化学技术。免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术---方法

（一）EnVision法1.特点EnVision法为采用聚合物技术的二步法,是非生物素检测系统,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭,具有敏感性高,操作简便和非特异性染色少的优点,已成为最常用的方法之一(图49)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒只

有EnVision/HRP/抗鼠/抗兔二抗工作液。不同编号的试剂盒有所不同，有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择EnVision/AP/抗鼠/抗兔二抗。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗,孵育10~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(9)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钅钟,蒸馏水洗5~10分钟。(10)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法LSAB(S-P)法1.特点LSAB法采用链菌抗生物素蛋白-生物素技术,其中链菌抗生物素蛋白与生物素具有很强的亲和力,三步法染色,加入的二抗和三抗可将抗原-抗体结合物不断放大,敏感性较高。高纯化的抗体技术,使背景更加清晰。为含生物素检测系统,需注意封闭内源性生物素。二抗含有抗鼠、抗兔和抗羊免疫球蛋白,适用于与鼠抗、兔抗和羊抗等一抗配套使用。价格较便宜(图4-10)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

包含生物素标记的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白(biotin-mouse/rabbit/goatlgG)工作液,标记HRP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/HRP)工作液。不同编号的试剂盒有所不同,有的还配有过氧化物酶阻断剂和显色剂。也可选择标记AP的链菌抗生物素蛋白(streptavidin/AP)。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)正常血清封闭后直接滴加一抗工作液,孵育30~60分钟:或孵育过夜(约16小时)。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加鼠/兔/羊二抗,孵育20~30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)滴加链菌抗生物素蛋白/HRP(三抗),孵育20~30分钟,37℃。(9)PBS洗5分钟,3次。(10)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(11)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(12)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---方法(三)EPOs法1.特点EPOS法采用聚合物技术的一步法,敏感性高。一抗不含生物素,可避免内源性生物素干扰,不需要进行封闭内源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封闭。最大的优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色。缺点是抗体种类不多,一抗只有标记HRP(图4-11)。免疫酶组织化学技术---方法2.试剂盒

不用检测试剂盒,只需要选用EPOS一抗即可。3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水。冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)3%的H2O2水溶液处理10分钟,蒸馏水洗,PBS洗5分钟。(4)滴加一抗工作液,孵育45分钟,37℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)DAB-H2O2显色1~5分钟,蒸馏水洗终止显色。(7)Mayer苏木精染色液复染细胞核3~5分钟,蒸馏水洗5~10分钟。(8)常规脱水透明,中性树胶封片。4.结果

阳性结果呈深浅不一的棕色,细胞核呈蓝色。免疫酶组织化学技术---质量控制1.组织离体后应及时固定,最理想的固定液为10%的中性缓冲甲醛液(pH7.2~7.4)固定时间为4~6小时,不超过24小时。固定不足或过度固定都不利于免疫组化染色。2.石蜡切片脱蜡要彻底,脱蜡不干净会造成局灶性阳性等染色不均匀的现象,甚至染色失败。3.是否进行抗原修复,可参考一抗说明书或实验室预实验结果来定。许多抗原检测进行抗原修复时,可以用热处理方法替代蛋白酶消化方法。不当的抗原修复会导致抗原定位发生改变,即应该细胞质阳性的则出现细胞核阳性等；也会引起假阳性或假阴性的结果。4.使用的二抗为HRP/鼠/兔,不需要考虑所用的一抗是鼠抗还是兔抗。5.在临床病理学诊断时,是否需要行免疫组化染色作为辅助诊断,如需要,选用多少种抗体,用哪一种抗体和哪一种克隆的抗体由诊断医师来决定。但技术员应了解和记录同种抗体中染色效果最好的厂牌和批号,每次使用新批次的抗体,都应该先做预实验来检测抗体的效价。如果更换不同类型的检测试剂盒,因敏感性不同,一抗的稀释度或一抗的孵育时间有可能不同,即使是即用型一抗都有可能需要稀释。一抗稀释度越大,背景染色越少,所以应选用较敏感的检测试剂盒,以提高一抗的稀释度。6.不同试剂盒标记的酶可能不同,应合理选用，与一抗和显色剂的配套使用。在HRP系统,可用AEC代替DAB显色,阳性结果呈深浅不一的红色。在AP系统可选用固蓝或固红显色剂,阳性结果呈深浅不一的蓝色或红色。除DAB显色外,用其他显色剂显色后,都不能用乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封片,只能用水溶性胶封片,而且不能长时间保存切片。除非行双重染色,一般应首选DAB为显色剂(表4-3)。免疫酶组织化学技术---质量控制免疫酶组织化学技术---质量控制7.手工染色时,抗体孵育切片应在37℃进行,使每次染色抗体孵育都能在恒定的温度下进行,不受室温的影响。在低温如4℃进行第一抗体孵育切片,时间可以延长至16~24小时,通常是过夜,更有利于与抗原抗体充分结合。8.滴加抗体要完全覆盖组织。在加抗体前用含0.05%吐温的PBS浸洗切片,可有效避免由于抗体表面张力的作用,在组织表面隆起而引起组织边缘出现假阳性的现象。9.加抗体前后均应用PBS充分浸洗切片,不必担心过多浸洗使抗原-抗体结合物解离。一般用3缸PBS,并保证第3缸PBS是新的,有利于减少非特异性染色。10.加抗体前要尽可能甩干切片上的PBS,残留的PBS对加入的抗体稀释度是很高的,会直接影响染色结果。11.在整个染色操作过程中,应避免切片完全干燥,否则会增加背景色和导致染色失败。12.染色过程中设立阳性和阴性对照非常重要,以验证抗体和检测试剂系统效价是否稳定,实验操作是否正确,从而确保染色结果的可靠性。用于阳性对照的组织蜡块和组织切片要注意经常更新,组织蜡块和组织切片保存一段时间后,有可能会出现组织抗原的丢现象。免疫酶组织化学技术---质量控制13.Mayer苏木精染色液仅着染细胞核,所以不用酸分化。如果阳性定位在细胞核,复染要稍浅。如果用甲基绿复染,细胞核呈绿色。滴加甲基绿前要将切片上的水分甩干,有利于细胞着染。14.组织切片背景深与下列因素有关,应注意避免。(1)第一抗体浓度太高。(2)抗体孵育时间过长。(3)抗体孵育温度过高。(4)DAB显色剂中DAB浓度过高或H2O2太多。(5)正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗切片。(6)抗体纯度不高。(7)抗体孵育切片后洗不干净。(8)内源性过氧化物酶的干扰。(9)内源性生物素的干扰。(10)在染色过程中发生干片现象。15.使用自动免疫组化染色机,可使染色操作自动化和标准化。但要注意对机器的维

护和保养,使机器保持在正常的状态下工作。免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光染色方法(一)直接法用荧光素标记的一抗直接与组织细胞特异性结合，即可在荧光显微镜下观察结果，直接法中只有抗原抗体特异性结合，没有连接其他抗体，所以特异性极高，非特异性染色少。但由于没有将抗原一抗体结合物放大，所以敏感性不及间接法。

免疫荧光染色方法及操作(一)直接法将抗体标记上荧光素→荧光抗体与组织细胞抗原结合→形成有荧光素的抗原-抗体结合物→激发光(紫外光)照射,荧光素发出可见荧光→荧光显微镜观察。1.特点

最大的优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色;缺点是抗体种类不多。目前荧光一抗主要用于肾穿刺和皮肤的病理诊断,多数是兔源抗体,标记FITC。2.检测试剂盒

不需检测试剂盒,只需要选择目的荧光标记的一抗。免疫荧光染色方法及操作3.染色步骤(1)冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗,PBS洗。(2)滴加荧光标记一抗工作液孵育45分钟,37℃。(3)PBS洗5分钟,3次。(4)晾干或甩去PBS用缓冲甘油封片。4.结果

阳性结果荧光呈明暗不一的亮黄绿色(FITC标记抗体)或橙红色(TRITC标记抗体)。免疫荧光染色方法及操作(二)间接法先用目的一抗与抗原特异性结合,再加入荧光素标记的二抗与一抗连接,然后在荧光显微镜下观察结果。间接法中加入二抗,将抗原-抗体结合物进一步放大,所以敏感性较高。将第二抗体标记上荧光素→第一抗体与组织抗原结合→第二抗体与第一抗体结合→形成有荧光素的抗原-抗体结合物→激发光(紫外光)照射荧光素发出可见荧光→荧光显微镜观察。免疫荧光染色方法及操作1.特点在染色中加入荧光素标记的二抗与一抗结合,使抗原一抗体结合物不断放大，敏感性较高。一抗不需标记荧光素,和兔疫组化染色一样可选择的一抗种类多,用一个检测试剂盒就可以分别检测各种抗原。间接法除了用冷冻切片外,还可以用石蜡切片。2.测试剂盒没有专门做免疫荧光染色的检测试剂盒,通常是根据所用的一抗选择单一的荧光素标记二抗。目前可供选择的主要有标记FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及TRITO标记的抗兔和抗鼠二抗,必要时还可以选择非免疫正常血清,可供选择的封闭用正常血清有羊、兔和马血清。免疫荧光染色方法及操作3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水,冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时石蜡切片进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)必要时进行正常血清封闭10分钟,甩去血清,不洗。(4)滴加一抗工作液孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加荧光素标记二抗孵育30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)晾干或