微生物限度、无菌的试验与方法学验证集结帖

2005版药典颁布以后，在微生物限度、无菌试验以及方法学考察方面大家有了很多的疑问和问题。在我们抗生素工作网站论坛中大家都根据问题进行了很多的讨论和研究，使所有参与的朋友都有所收获。为了更方便大家查阅已经讨论过的问题，我们开设了这个微生物限度、无菌的试验与方法学验证集结帖。希望大家能将自己提出的已经被别的朋友明确解答的问题、或者您回答的别人的问题且已经得到认可的，依据我们提供的格式整理好粘贴在这里。我们将对于大家贴出的内容进行整理和归类，并且请相关的专家复核后，集结成册。同时加入咱们在试验中常用的一些参数，器材的规格数据表格、附录。编一个咱们抗生素工作网站论坛自己的工具书我们希望能完成这样一个东西给大家，作为我们网站对于大家的一种回报吧。具体大家集结的问答格式如下：问：答：关键词：举一个例子：问：生孢梭菌如何传代?答：半固体培养基穿刺培养，或者用硫乙醇酸盐流体培养基培养传代。关键词：生孢梭菌传代这样就完成了一个帖子，大家只要在咱们当前这个帖子一个个回复下去就可以了，这个帖子会长期存在，完成集结后，大家也可以方便的在这里检索问题，寻找已有的答案。我们问题收集的工作是长期存在的，但是为了集结这个工具手册给大家，我们第一阶段问题收集时间暂时定在：2006年8月28日至2006年10月8日10月8日后我们会进行整理复核工作，希望年内能把这个工具手册带给大家。因为这个帖子是集结帖子，因此只接受大家提交的问答集结帖，请不要在这个帖子里面进行其他内容的回复，如有不明白的地方或者任何一件和建议请大家另开帖子提出，这样方便我们最后的整理工作。我们的水平有限，我们只希望能够用我们自己微薄的力量给大家的工作带来一点点便捷。希望大家支持我们，谢谢。发酵清道夫2007-11-0321:25问：如何理解培养基稀释法?答：通过增大培养基的量来稀释供试液,从而消除供试品抑菌作用常用的一种方法。关键词：培养基稀释法发酵清道夫2007-11-0321:26问：培养基稀释法中每皿的加菌量是多少,如何理解?答：每皿加菌量为50—100CFU/ml的菌液1ml.原因为.①培养基稀释法稀释的为供试液,而非菌液;②只有每皿加1ml菌液,每皿的菌数方能符合菌数计数规则(细菌酵母菌30~300,霉菌30~100),药典附录中所要求的菌液稀释所达到的每毫升菌落个数才有意义;

关键词：培养基稀释法加菌量发酵清道夫2007-11-0321:26问:培养基稀释法的取液量和平皿数具体为多少?答:以0.2ml/皿为例,

①试验组：最低稀释级供试液0.2ml+1ml菌液

2个平皿

②菌液组：1ml菌液

2个平皿

③供试品对照组：最低稀释级供试液0.2ml

2个平皿

④稀释剂对照组：稀释剂0.2ml+1ml菌液

2个平皿关键词：培养基稀释法发酵清道夫2007-11-0321:26问：如何理解中国药典中纯化水的微生物限度检验方法?答:⑴药典规定纯化水：微生物限度取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录ⅪJ），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。

⑵取样量与方法:取样量可以为1ml或是10ml或者其他体积,最后换算成1ml便可.但是方法一定是薄膜过滤法.因为薄膜过滤法可以将供试液经抽虑后可以将可能存在的有抑菌作用的成分滤去,可以防止有抑菌作用的成分影响结果,常规法却不能.

⑶USP-29中关于纯化水的检验方法与检验量都没有具体规定:METHOD:“POURPLATEORMEMBRANEFILTRATIONMETHOD”,SampleVolume:“1.0mLminimum,－amaximumsamplevolumeofaround250to300mLisusuallyconsidered－，－whensamplevolumeslargerthanabout2mLareneeded－”.与我国药典唯一的不同就是,我们规定了方法,这也是我们的药典委员会根据我国国情所制定的具有中国特色的检验方法之一.

(4)药典纯化水正文中规定了微生物限度的方法,所以不需要大家再验证;

(5)药典中正文和附录都未要求纯化水做控制菌的检查,所以也不需要做.关键词:纯化水微生物限度检验发酵清道夫2007-11-0321:26问:如何理解药典附录中无菌检查检验量的问题答:⑴检验量

①若每支（瓶）供试品的装量按药典附录表2、表3规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。每个容器装量不够接种两种培养基，检验容器数加倍。

②薄膜过滤法的检验量应不少于直接接种法的总接种量（接种两种培养基的量的和）

③只要供试品特性允许（包括溶解性，抑菌性等），应将所有容器内的全部内容物过滤。

④若由于供试品的特性（如抑菌作用太强），按要求对其供试液进行处理后，还不符合验证试验的规定，那么检验量可酌情减少，但是每支（瓶）供试品的取样量应不少于直接接种法的供试品总接种量。⑵阳性对照试验的供试品数量一般情况下：供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。⑶总取样量（足够接种三份培养基）①

批出厂检验依据：生产量、装量、产品特性。举例：注射剂,批（柜）生产量

＞1000个每种培养基最少检验数量

20个–2%或20个（取较少者）

装量

≤1ml（全量接种）,

直接接种法40+1=41个容器

薄膜过滤法40+20=60个容器装量1＜V＜5ml（半量接种）,

直接接种法20+1=21个容器

薄膜过滤法20+10=30个容器装量5≤V＜6ml（接种2ml）

直接接种法20个容器

薄膜过滤法20+10=30个容器装量6≤V＜20ml（接种2ml）直接接种法

20个容器

薄膜过滤法

一般产品

20+10=30个容器

特殊产品（如抑菌作用很强）20个容器，需要时，可不全部过滤。②上市抽验样品(略)关键词:无菌检查检验量发酵清道夫2007-11-0321:27问:生化培养箱、.霉菌培养箱、恒温恒湿培养箱的区别答:1.生化培养箱主要用于生化反应的孵化,所以它们的门主要由玻璃组成,用于在特定温度孵化反应,操作者可在不破坏反应条件的前提下在外观察反应的变化;亦可用于细菌霉菌与控制菌的培养.2.霉菌培养箱与生化培养箱大体相同,其区别在于多了一个灭菌开关,用于杀灭霉菌的孢子;3.恒温恒湿培养箱主要用于培养细菌和控制菌,正如其名,其密封性好,温度和湿度都是可控恒定的,但不便于在外观察;关键词:培养箱发酵清道夫2007-11-0321:27问:什么情况下需要做沙门菌检查?答:含动物组织（包括提取物）及动物类原药材粉（蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外）的口服给药制剂需要做沙门菌检查关键词:沙门菌发酵清道夫2007-11-0321:27问:什么情况下需要做大肠菌群检查,意义何在?答:(1)含药材原粉的制剂需要做大肠菌群的检查

(2)大肠菌群是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的一类革兰阴性无芽孢杆菌。除大肠埃希菌属外,它还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属,基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性,且存活时间较长，也较容易检出。检出大肠埃希菌，一般认为药品受近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受近期或远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。国际上以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌之一。关键词:大肠菌群发酵清道夫2007-11-0321:27问:原料（中药提取物）及辅料的微生物限度如何检查?答:参照相应制剂的微生物限度标准执行。关键词:原料微生物限度发酵清道夫2007-11-0321:27问:微生物限度检查是否都需要取连续2-3个稀释级?答:常规法取适宜的连续2-3个稀释级进行检查;非常规法取验证时的稀释级(最低稀释级)按验证后的方法进行检查关键词:微生物限度检查稀释级发酵清道夫2007-11-0321:27问:微生物限度检查验证思路答:首先我们应该了解所验证品种的各成分及其药理作用，本着由易到难，由简到繁的原则选择合适的方法.一般情况下从最简单的常规法做起，最好同时做一个培养基稀释法,培养基稀释法操作简单,菌损失率较小,成本较低,有抑菌作用品种的验证建议大家尽量采用该方法;但并不是所有抑菌作用弱的供试品都适用,如果该法的回收率仍低于70%，然后再选用薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法等，最后再考虑联用;离心沉淀法的菌损失率较大,建议大家尽量少用.关键词:验证思路发酵清道夫2007-11-0321:28问:微生物限度检查中供试液的稀释级如何选择？答:平皿法即常规法需要按药典要求"应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液";其他方法如培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等按验证所采用的稀释级进行检查关键词:稀释级发酵清道夫2007-11-0321:28问:什么是滤膜的起泡点试验?答:起泡点试验（Bubble-PointTests）：滤膜起泡点是推动空气通过被液体充满的滤膜所需的压力，当压力不断增加并达到克服滤膜上较大孔中液体表面张力时，则液体从孔中流出，气泡就出来了，这个压力值即是起泡点。该测试可在水中、异丙醇、药液及其他液体中进行。测试液应将滤膜浸湿（填满膜孔），并且与滤料的实际应用液体相似。确保测试液与滤料之间的相容性也很重要，否则测试结果可能无效。关键词:起泡点发酵清道夫2007-11-0321:28问:何为光复活现象?如何减少其导致的不良后果?答:经紫外线照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显的降低其死亡率的现象称为光复活作用。光复活作用首先于1949年在放线菌中发现。引起的原因是可见光所激活的酶在起作用，经紫外线照射后形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中会与一种光激活酶结合形成复合物，当再暴露在下可见光时，复合物会因获得光能而使酶与DNA分子解离，从而使胸腺嘧啶二聚体重新分散成两个胸腺嘧啶单体，同时光激活酶也从复合物中释放出来。各种不同的微生物均由于紫外线的照射受到损伤以致死亡。但任何生物均对损伤有一定的修复能力，微生物也不例外。微生物的紫外线损伤能被可见光所逆转称为光复活，有效的波长范围包括330nm～480nm的可见光和近紫外光。修复情况因微生物的种类和受紫外线打击的程度而异。一些缺乏光复活酶的微生物无光复活能力。紫外线的照射量增加，光复活率降低，当照射剂量达到60000μW／cm2时，大肠杆菌的光复活消失。关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟，可以有效避免光复活作用的出现关键词:光复活发酵清道夫2007-11-0321:28问:何为高效消毒剂?答:高效消毒剂：指可杀灭一切细菌繁殖体(包括分枝杆菌)、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽胞也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。包括含氯消毒剂、臭氧、甲基乙内酰脲类化合物、双链季铵盐等。常用的主要是含氯消毒剂,它包括：无机氯化合物，如次氯酸钠(10%至20%)、漂白粉(25%)、漂粉精(次氯酸钙为主，80%至85%)、氯化磷酸三钠(3%至5%)；有机氯化合物，如二氯异氰尿酸钠(60%至64%)、三氯异氰尿酸(87%至90%)、氯铵T(24%)等.关键词:高效消毒剂发酵清道夫2007-11-0321:29问:控制菌验证时如何消除供试品的抑菌作用?

答:对于控制菌的验证,如果常规法行不通,那我们就必须选用其他方法消除其抑菌作用.培养基稀释法中和法离心沉淀法薄膜过滤法我们都可以用.

培养基稀释法:虽然供试液的量我们不能减少,但我们可以将培养基的量增加,大肠埃希氏菌检查可以将胆盐乳糖增加至200ml或更多,大肠菌群检查可以将乳糖胆盐发酵培养基增加至20ml或更多,沙门菌检查可以将营养肉汤增加至400ml,等等;

中和法即将中和剂加入到相应的的培养基中;

离心沉淀法即将离心集菌后的供试液取规定量加至相应的培养基中;

薄膜过滤法即将规定量的供试液过滤后取滤膜至相应的培养基中

关键词:控制菌验证发酵清道夫2007-11-0321:29问：药典附录上说的菌液制备“上述培养物用％无菌氯化钠溶液制成每一毫升含菌数为50~100cfu的菌悬液”这一句话中，菌悬液是怎么确定含菌数为50~100cfu？

答：按10倍递减稀释法.例如取1白金饵的大肠杆菌新鲜培养物至10mL的营养肉汤培养基中培养18－24小时后；取加入至10mL的％无菌氯化钠溶液中；摇均按10倍递减稀释法稀释至10-6~10－7即取1mL，加入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待培养基凝固后，放置于30~35度培养箱中培养，48小时后记录菌落数。既得每mL的菌落数。如果是用营养肉汤和改良马丁培养基，则培养18~24小时后，直接用培养物以10倍递增稀释，按照我们的经验：大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的培养物应稀释至10-8~10-9左右，枯草杆菌应稀释至10-5~10-6左右，白色念珠菌应稀释至10-5左右；其每1ml菌液的含菌数就在50~100个附近。如果是用营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基，则培养18~24小时后，先把菌苔刮到0.9%无菌氯化钠中，黑曲霉只取其孢子，然后用细菌比浊管比浊，再按比浊后所标示的菌液浓度以10倍递增稀释至所要的浓度。取上述稀释后的菌悬液各1ml放入灭菌平皿中，（最好连续3个稀释度，每个稀释级度应做2ml）立即加入相应的45℃琼脂培养基（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌用营养琼脂，白色念珠菌和黑曲霉用改良马丁琼脂）混匀后置规定的培养温度培养，培养（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌30~35℃培养48小时，白色念珠菌和黑曲霉23~28℃培养72小时）后计数即可确定每1ml菌液含50~100个菌的稀释级别。

关键词：菌液制备活菌计数发酵清道夫2007-11-0321:29问:如何选择中和剂及其用量?

答:中和法应特别注意所用试剂对微生物的损伤，须通过试验证明其可行性，若无报导，试验菌株的范围要广。表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响.而且所加中和剂的量也需要验证,在消除抑菌作用的前提下,越少越好,否则会造成琼脂不易凝固(加到培养基中情况)和试剂的浪费.

目前验证过的中和剂有:倍他内酰胺酶和MnSO4.

1.倍他内酰胺酶用于倍他内酰胺类药物,具体用量根据品种选择验证.

用于喹诺酮类药物.

中检所在<加替沙星无菌检查验证试验>中,从FeCl3(其溶液在湿热灭菌时即浑浊,而且对细菌生长有抑制作用,所以淘汰)和MnSO4两种试剂筛选出MnSO4,用量为每筒培养基中的溶液.其原理为利用金属离子的络合作用，可以降低喹诺酮药物的活性,从而消除其抑菌作用.

喹诺酮类药物的微生物限度验证和无菌验证,我们可以直接选用MnSO4作为中和剂,但具体需要好多量,我们可以中检所加替沙星验证所用的量作为参考,寻找一个最适宜的量.

其他品种如若选用其他中和剂,都必须重新验证.

关键词:中和剂发酵清道夫2007-11-0321:29问：无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液和0.1%蛋白胨溶液的灭菌温度及灭菌时间各为多少？

答：氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌和普通灭菌一样(121摄氏度兆帕)

关键词：缓冲液灭菌温度、时间发酵清道夫2007-11-0321:30问：全封闭滤器过滤为何如此的慢?答：首先检查仪器的蠕动泵是否坏了，和滤器的密闭性是否合格

其次检查过滤的操作是否规范：过滤时，蠕动泵应该继续运作，同时滤筒上的帽子应该盖紧，利用空气的压力将供试液或冲洗液压滤下去，而不是让其自然滤过。

关键词：全封闭滤器

过滤蠕动泵压力发酵清道夫2007-11-0321:30问：净化工作台（二级生物安全柜）的初效/中效/高效过滤器应该多久清洗/更换一次？答：初效过滤器：可以取出来清洗，清洗时从干净的一面向灰尘较多的一面冲洗，至于清洗频率，可根据实际情况制定。（个人经验：一季度1次即可）

中效/高效过滤器：维护者可定期测试其过滤性能，以尘埃粒子数/沉降菌数作为其性能指标，超出标准时则应及时更换（所以应有备用过滤器）关键词：初效/中效/高效过滤器频率发酵清道夫2007-11-0321:30问：菌液用注射器从过滤器上面加入，加菌液后摇均过滤成片状不能计数，可能原因

有：

答：

1.抽虑时没有抽虑干净，膜上尚保留有液体

2.加菌液后没有摇均

3.培养基中水分过多

关键词：滤器过滤成片状原因发酵清道夫2007-11-0321:30问：对于喹诺酮类药物验证中所用中和剂的选择及其量答：中和法应特别注意所用试剂对微生物的损伤，须通过试验证明其可行性，若无报导，试验菌株的范围要广。表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响.而且所加中和剂的量也需要验证,在消除抑菌作用的前提下,越少越好,否则会造成琼脂不易凝固(加到培养基中情况)和试剂的浪费.对于喹诺酮类药物验证中所用中和剂MnSO4及其量(0.1mol/L,5ml/筒)来自中检所<加替沙星无菌检查验证试验>研究所得出的结果.喹诺酮类药物的微生物限度验证和无菌验证,我们可以用MnSO4作为中和剂,但具体需要好多量,我们可以中检所加替沙星验证所用的量作为参考,寻找一个最适宜的量.关键词：喹诺酮类药物验证中和剂发酵清道夫2007-11-0321:30问：煮沸消毒法中为何加碳酸钠或石碳酸效果更佳?答：加碳酸钠或碳酸氢钠的目的为提高水的沸点，可以提到到105摄氏度，还可以去污去锈；详细请查阅物理化学或化学手册

石炭酸又名来苏尔，本身就是化学消毒剂，可以加强消毒效果关键词：煮沸消毒法碳酸钠或石碳酸发酵清道夫2007-11-0321:31问:对微生物检品取样工具有什么要求？答:微生物检品取样工具，1、一次性耗材

2、能够反复使用的耐高温、高压、不易与药品产生反应。关键词:取样工具要求发酵清道夫2007-11-0321:31问：黑曲霉的传代是否和其它菌一样?我之前接好的第二代黑曲霉是白白的,呈棉絮状,用普通方法是否能够传代?请问斜面如何保持干燥？

答:黑曲霉就是这样的,前7天生长的白色物质是菌丝体,后期培养基中的营养用完了才会产生黑色的孢子～这是正常的生长状态,注意传代时的改良马丁斜面培养基要保持干燥,水分过多的话孢子颜色会偏黄.把培养基放在35℃的恒温培养箱里培养1天，应该可以去掉水分的。

关键词：黑曲霉传代干燥发酵清道夫2007-11-0321:31我也没怎么来过帮大家整理几个吧：

问：薄膜过滤法做限度验证，药典中说冲洗量过大有可能会造成微生物的损伤，是说的供试品中的微生物吗？一般冲洗量在什么范围内算是适当呢？还有冲洗量过大会损伤薄膜而影响到最后所加菌的充分截留吗？

答：一般冲洗体积每张膜不应大于1000ml。根据我们的实验经验，实际上一种冲洗液达到500ml/膜时就已经达到冲洗极限，也就是说到500ml冲洗时还不能有效去除抑菌活性，再通过增加冲洗体积一般也无济于事，这时应考虑改变冲洗条件，比如增加冲洗液温度（45度）、添加表面活性剂（％土温80等）；再不奏效，就得考虑添加中和剂。上述经验也可能与所使用的实验器材（主要是膜材质）有关。

关键词：薄膜过滤法冲洗量

引用：发酵清道夫2007-11-0321:31问：低速离心辅料不容易离干净，还有其它方法吗？大部分需离心的片剂都不容易离干净，如罗红霉素片。

答：供试液低速离心只能解决沉降系数比较大的固体颗粒干扰，对于一些新型辅料，比如微晶纤维素等是难以奏效的。目前可尝试采用如下方法：取供试液上清液（静置、或低速离心）适量，转移到一中试管，从管口推入一小团疏松的无菌棉花，一直到液面以下，用移液管在棉花上部取液实验。

关键词：离心敷料干扰

引用：发酵清道夫2007-11-0321:31问：开放式薄膜过滤器,滤膜应该采用什么方法灭菌

答：1，湿热灭菌法适合少量且膜尺寸会有缩小2，钴60辐射灭菌,一张膜用一个塑料袋包好,一次去灭菌500到1000张膜,效果很好3，购买成品已灭菌膜

关键词：滤膜灭菌发酵清道夫2007-11-0321:31问：生化、霉菌、恒温培养箱怎么区分和选择？

答：1.生化培养箱主要用于生化反应的孵化,所以它们的门主要由玻璃组成,用于在特定温度孵化反应,操作者可在不破坏反应条件的前提下在外观察反应的变化;亦可用于细菌霉菌与控制菌的培养.2.霉菌培养箱与生化培养箱大体相同,其区别在于多了一个灭菌开关,用于杀灭霉菌的孢子3.恒温恒湿培养箱主要用于培养细菌和控制菌,正如其名,其密封性好,温度和湿度都是可控恒定的,但不便于在外观察;总之,三种培养箱各有所长,使用者可根据自己的具体需要选择

关键词：培养箱的选择

引用：发酵清道夫2007-11-0321:32问:为什么验证时试验组中菌液和供试液在加培养基之前尽量避免混合?

答:验证是考察供试品经所用方法处理后对微生物抑制能力的消除程度,所以在注皿前一定保证微生物是处于成活的状态,真实地反应微生物在有营养成分的良好培养条件下(我们人体便是一个很好的培养环境)与供试品作用的结果.否则,便失去了我们验证的意义.故验证的过程中,试验组中菌液和供试液在加培养基之前尽量避免混合,然后尽快倾注培养基.

关键词:混合发酵清道夫2007-11-0321:32问:2005版中国药典及各国药典对于回收率如何规定?

答:关于回收的限率问题,各国药典规定不同.;EP、BP、JP:各试验菌的回收率均不低于80%;2005版中国药典及USP：各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%.各国设定下限都只是根据各国的实际情况和统计数据对方法所制定的一个门槛,旨在考察供试品经所用方法处理后对微生物抑制能力的消除程度.对于它的上限,根据药典委员会的专家推荐,以不超出120%为限.

答:回收率发酵清道夫2007-11-0321:32问：常用菌种及培养基英文对照答：Bacillussubtilis枯草芽孢杆菌Bacilluspumilus短小芽胞杆菌Staphylococcusaureus金黄色葡萄球菌Micrococcusluteus藤黄微球菌Escherichiacoli大肠埃希杆菌Saccharomycescerevisiae啤酒酵母菌Candidaalbicans白色念珠菌Aspergillusniger黑曲霉SalmonellaparatyphiB乙型副伤寒沙门(氏)菌Pseudomonasaeruginosa铜绿假单胞菌Coliform大肠菌群Clostridium梭菌Nutrientagar营养琼脂培养基RoseBengalagarSodium玫瑰红钠琼脂培养基Nutrientbrothmedium营养肉汤培养基Thioglycollatemedium硫乙醇酸盐流体培养基Martinmediummodified改良马丁培养基Bilesaltlactoseenrichment胆盐乳糖培养基％peptonewatermedium0.1%蛋白胨水氯化钠－蛋白胨缓冲液Lactosebilesaltfermentationmedium乳糖胆盐发酵培养基DHL（deoxycholateH2Slactoseagar）agarmedium胆盐硫乳琼脂培养基Tetrathionateenrichmentbasemedium四硫磺酸钠亮绿基础培养基Eosiamethyleneblueagarmedium曙红亚甲蓝琼脂培养基关键词：菌种培养基英文对照发酵清道夫2007-11-0321:32问:该如何理解“常用供试液制备方法：

1、液体供试品——取供试品10ml，加氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试品液。（请问，这里加氯化钠蛋白胨缓冲液是90ml还是90ml以上，大概估计到100ml？2000年版说的很明白90ml稀释液）

2、固体供试品——取供试品10g，加氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，（请问，这里又该加氯化钠蛋白胨缓冲液是90ml，或者90多ml，或者100ml？2000版为100ml稀释液）

[按照2005年版，在制备供试液时该如何加入稀释液（氯化钠蛋白胨缓冲液）]

答:

2005年版药典二部附录：“常用供试液制备方法：液体供试品、固体供试品——取供试品10ml，加氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试品液。

“加至”应理解为“稀释液”与“供试品”的总量为100ml。作为固体供试品，称取2005版药典规定g数，置灭菌量筒中，加入氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，再移至其它匀浆容器，混匀！

对于液体样品，可以这样操作：取100ML灭菌量筒加入10ML样品，加稀释剂至100ML刻度！

关键词:供试液制备发酵清道夫2007-11-0321:33问:黑曲霉传代和保藏的方法

答:(1)黑曲霉孢子悬液，冰箱4-8℃进行保藏,保藏时间为1个月;

(2)改良马丁琼脂斜面低温保存法，保存2～3个月

关键词:黑曲霉传代保藏发酵清道夫2007-11-0321:33问:无菌用培养基的无菌检查和灵敏度检查隔多长时间再复测？

答:认为无菌检查用培养基的无菌性检查，应该每配制一次就做一回（因为培养的时间为14天，可以随样品的无菌检查同时进行），这样做即便是有样品染菌，在你分析原因时也可以少排除一项。至于培养基的灵敏度检查，培养基换批号或厂家，要做灵敏度实验;在批号不换的情况下，本人认为如果同一批号使用半年以上，应该再作一次灵敏度检查，如果发现培养基的味、外观性状有所改变，应该及时作灵敏度检查。总之，应处处小心，才能步步为赢。

关键词:培养基无菌灵敏度发酵清道夫2007-11-0321:33问:玻璃器皿用湿热灭菌121℃灭菌多长时间？

答:玻璃器皿用湿热灭菌121℃灭菌30min。

关键词:玻璃器皿湿热灭菌发酵清道夫2007-11-0321:33问:常用的消毒剂有哪些?

答:5～20倍稀释的碘伏水溶液

0.1%新洁尔灭溶液

1:50的84消毒液

75%乙醇溶液

3%碘酒溶液

5%碳酸(来苏儿)消毒溶液

2%戊二醛水溶液

尼泊金乙醇消毒液(具体配置不详)

关键词:消毒剂发酵清道夫2007-11-0321:34问:适宜药厂检验室,菌种的保藏方法?

答:大肠/金黄色葡萄球菌/沙门低温斜面保藏,2～8℃,1～2个月;

绿脓常温斜面保藏,1～2个月;

枯草低温斜面保藏,2～8℃,3～6个月;

生孢硫乙醇酸盐流体培养基低温保藏,2～8℃,2～3个月;

白色念珠低温斜面保藏,2～8℃,3～6个月;

黑曲霉低温斜面保藏,2～8℃2～3个月;(有误请发论坛消息给我指正,这是我目前用的方法,谢)

关键词:菌种保藏发酵清道夫2007-11-0321:34问:如何使验证实验在制备供试液后1小时做完?

答:小窍门:统筹安排验证试验,把时间合理化.

举例常规法1制备菌液放到中午临近下班时来完成.2下午一上班就开始验证试验前期工作,进行供试液的制备3按预先安排进行验证4完成验证试验后,进行规定的培养.

很多人把菌液稀释拿到和制备供试液一起来做,1小时肯定要超.

关键词:验证发酵清道夫2007-11-0321:34问:常用的灭菌参数?

答:湿热灭菌121℃15min(灭菌培养基等);

湿热灭菌121℃30min(灭菌不宜干烤的玻璃器皿常用)

干烤灭菌160～180℃2小时

干烤灭菌250℃至少1小时(除外源内毒素用)

关键词:灭菌参数发酵清道夫2007-11-0321:34问:培养基如何调PH?答:一般培养基的PH值规定范围都精确到小数点后一位，比如说的氯化钠－蛋白胨水要求为，PH试纸是不能满足此精确度的，只能用PH计调；

由于灭菌后调PH要想保持无菌，调节PH值所用滴管、溶液乃至PH的电极必须也要灭菌，其中某些条件显然是无法到达的，所以只能灭菌前调PH；

由于大部分培养基中某些成分（比如说牛肉、蛋白胨等）经高温灭菌后会产酸导致PH变低，故培养基在配制完毕后调节PH值（调高）再灭菌。控制培养基的PH值目的是使微生物能够良好生长的，而培养（23℃～28℃，30℃～35℃）的温度在室温左右，所以应该在室温（10～30℃）条件下调PH.关键词:培养基PH发酵清道夫2007-11-0321:35问:TTC的作用?答:TTC是氯化四唑，即2，3，5－三苯基氯化四唑，它的无色溶液可以做指示剂，可以显示活细胞中所发生的还原过程。再活细胞中，2，3，5－三苯基氯化四唑经氢化作用，生成一种红色稳定的不扩散物质三苯基甲月替，可以帮助我们识别菌落关键词:TTC发酵清道夫2007-11-0321:35问:纯化水的验证与检查答:GMP有规定:纯化水系统安装之后需要验证其管道消毒效果的验证,验证期间:最远处管口需每日验证,持续一年其他各管口需一周全部验证一遍,持续3周验证完毕,每周需检查,而每管口需一月轮一次关键词:纯化水验证与检查发酵清道夫2007-11-0321:35问:每一个药的无菌检查验证是否也要像限度验证那样重复做3次呢？

答:一次就可以了，不过记得要做培养基的灵敏度检查和同时做无菌性检查哦注意：不同品种的药品（不包括厂家、批次不同），无菌检查验证、微生物限度限度验证一定要重复做3次！

关键词:无菌检查验证次数

转贴自:发酵清道夫2007-11-0321:35问:做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？

答:严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的.如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基.无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。只是注意：1、避免人为污染。2、阳性菌加入数量，符合“2005版中国药典XIJ微生物限度检查法”的规定。

关键词:阳性对照菌

引用:发酵清道夫2007-11-0321:35问:离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.注意事项:真菌由于沉降系数比较小,500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.关键词:离心沉淀法发酵清道夫2007-11-0321:35问:稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?答:是;

原因:一实验期内可能会染菌;二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。关键词:稳定性实验发酵清道夫2007-11-0321:36问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?答:液体制剂:无菌检查;半固体及固体制剂:微生物限度检查关键词:眼部给药制剂发酵清道夫2007-11-0321:36

问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?答:一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;二滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。三同时,中国已加入WTO,进出口药品已有明确质量要求(在国外药典中,眼用药品都以无菌要求),同时临床用药更加合理与规范。故现行药典将滴眼剂的卫生标准统一为强制性无菌要求。关键词:滴眼液无菌检查发酵清道夫2007-11-0321:36问:如何进行灭菌验证?答:可用生物指示剂进行验证,湿热灭菌:湿热脂肪芽孢杆菌孢子干热灭菌:枯草芽孢杆菌孢子以上两种北京四环卫生药械厂均有卖,网址:关键词:灭菌验证发酵清道夫2007-11-0321:36问:为何洁净度沉降菌的检查只用营养琼脂?答:一玫瑰红钠培养基对细菌的生长有抑制作用,而营养琼脂对于真菌的生长则没有抑制作用,所以选用营养琼脂作为培养基二营养琼脂主要为培养细菌,而且培养时间是2天,原因为细菌为原核生物,生长与繁殖的能力较霉菌等真核生物强,所以控制了细菌,霉菌等真菌也在一定程度上也得到了控制三厂家在制定自己的内控标准时,可以同时对细菌和真菌进行控制.关键词:沉降菌发酵清道夫2007-11-0321:37问:微生物培养时间范围如何界定?答:含量测定所允许的误差为±2%,如果照此限度,无菌培养时间为14天*24小时/天=336小时,它的2%为小时,前后共小时;又加上无菌检验没有必要达到含量测定所要求的精度,所以我们完全可以在培养的第十四天的任何上班时间观察结果下结论.微生物限度检查培养时间分别为48小时及72小时,它们的2%分别为小时小时,即我们只能在准确培养时间的前后1~2小时内计数.关键词:微生物培养时间发酵清道夫2007-11-0321:37问：抗生素乳膏，需加聚山梨酯80、司盘、单硬脂酸甘油酯乳化，后离心集菌（离心后不分层），再薄膜过滤。但基质堵住膜孔，过滤速度非常慢，怎么办？

答：1、可以用十六烷酸异丙酯萃取基质，使之分层，取水层进行薄膜过滤（回收率差）。

2、样品加入吐温-80，乳化（45度）薄膜过滤。

关键词：抗生素乳膏、十六烷酸异丙酯、萃取、吐温-80、乳化（45度）、薄膜过滤发酵清道夫2007-11-0321:37问:陶瓦盖作用及使用范围

答:陶瓦盖的主要作用为防止菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数,通常在在效价测定中使用,在微生物限度检查中仅在易形成片状菌某些剂型如蜜丸、水丸中使用.

关键词:陶瓦盖发酵清道夫2007-11-0321:37问:如何根据消毒物品的特性确定合格的灭菌时间和温度?

答:一般情况下，含有糖分的培养基温度需控制在115℃15～20min，不含糖分的培养基温度控制在121℃15～20min，而含菌的培养基（使用过）温度需控制在121℃30min左右，此外每次使用时，应放入必要的监视指标。

关键词:灭菌时间温度发酵清道夫2007-11-0321:38问:如何减少培养基灵敏度下降引起的误差?答:目前大多数单位使用干粉培养基，使用较方便，但由于其极易吸潮，如存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。新鲜配制的培养基应在2℃～20℃避光保存，但不得冻结，保存时间不得过2周。硫乙醇盐流体培养基储存过程中，若氧化还原层超过1/5，须经水浴加热煮沸10min方可使用，但只限一次。否则可使培养基中糖、微生物和氨基酸受到破坏，影响质量

关键词:培养基灵敏度发酵清道夫2007-11-0321:38问:如何控制细菌的培养时间?

答:不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响样品经24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但变大，而且还有很多新生长出来的菌落，培养72h后，菌落数增加不多，但菌落明显变大，而且混杂的霉菌生长旺盛，影响结果的观察计数。同时这也是一些样品经72h培养后细菌总数技术有明显增加的一个原因。培养24h和培养48h计数结果有明显差异，后者合格率明显降低，所以在规定的培养环境下，应严格遵守培养时间，以便真实的反映出样品中细菌总数的水平。

关键词:细菌培养时间发酵清道夫2007-11-0321:38问:菌种保藏与管理应执行哪些程序?

答:菌种保藏与管理应有完整的程序，保藏的菌种必须具备该菌种的详细历史及有关资料。一般是首先填写菌种卡片，登记菌种名称编号，来源历史，形态特征，生化与血清学鉴定，以及菌种传代次数、最宜培养基和培养条件、保藏方法、贮存条件及保藏地址等

关键词:菌种保藏与管理发酵清道夫2007-11-0321:38问:青霉素酶的保存条件及温度对其活性的影响

答:青霉素酶能够在4℃保存6个月以上活性不发生显著改变。与同时采用的加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的方法比较,没有显著的不同;

温度对青霉素酶的活性影响很大。55℃时对青霉素G呈现最高水解活性,随着温度的升高或降低,酶水解活性逐渐下降。缓冲液pH对酶活性存在一定的影响,最适酸碱度为pH7.0,在应用本酶进行青霉素制剂无菌检查等应用时,需特别注意测试温度及酸碱度的影响.

关键词:青霉素酶保存发酵清道夫2007-11-0321:39问：十四烷酸异丙酯的灭菌方法？

答：1、过滤除菌。

2、高压蒸汽灭菌121℃30min。发酵清道夫2007-11-0321:39问：带专有溶酶的供试品的无菌检查？

答：有些供试品带专有溶酶，而且溶酶的标准是附在样品标准中的，进行无菌检查需要单独进行；验证当然也要分开了。

关键词：溶酶、单独进行发酵清道夫2007-11-0321:39问：无菌检查中，哪些样品需用直接接种法？

答：无菌检查大多采用薄膜过滤法。经前处理后，仍难过滤的样品可采用直接接种法。

关键词：无菌检查、薄膜过滤法、直接接种法发酵清道夫2007-11-0321:39问：阳性菌和样品是否需要分别培养？

答：阳性菌和样品需要分别培养，若条件允许，最好分房间培养。

关键词：阳性菌、样品、分别培养发酵清道夫2007-11-0321:39问：干燥培养基吸潮问题？

答：放在10到15摄氏度的冰箱中保存。关键词：干燥培养基、吸潮、10到15摄氏度发酵清道夫2007-11-0321:40问：抗菌类药物的微生物检查有必要么?

答：对抗细菌药，它的种类繁多，抗菌的作用也不尽相同，有的细菌也只是暂时失去了活性，当抗菌作用消除后，细菌仍可表现出它的活性，所以，需要找出合适的方法，消除其抗菌的活性，才能说明药品是否真的没有菌，做检查当然有必要。关键词：抗菌类药物、微生物检查发酵清道夫2007-11-0321:40问：无菌检验培养期间，滤器的膜下面有气体，导致薄膜向上供起，薄膜表面有小气泡冒出，培养基澄清，什么原因？

答：滤器质量不好，导致薄膜脱落，结果无效，试验应重做。

关键词：薄膜、滤器质量、结果无效发酵清道夫2007-11-0321:40问：验证时阳性菌计数不规律怎么办？

答：稀释培养（稀释菌液置4度低温保存）计数作为验证试验的阳性菌使用。

关键词：验证、保存、计数发酵清道夫2007-11-0321:40问：如何减少或消除培养基制备过程中的气泡，尤其是胆盐乳糖培养基？

答：灭菌时将冷空气排除干净;将装有胆盐乳糖培养基的试管在培养基不接触试管塞的前提下倾斜,直至杜氏导管中的气泡排除.

关键词：气泡、冷空气发酵清道夫2007-11-0321:41问：标准灭菌时间

按F0=Ft*10(t-121)/10计算，F0要大于8，在160--170度是短时间就能做到的，为什么干热灭菌要两小时以上呢？

答：湿热灭菌和干热灭菌的效果是不同的，饱和蒸汽的穿透性比干热空气穿透强得多,蒸汽冷凝时放出的潜热传给待灭菌品,使之升温并使待灭菌品所带的微生物尤其是表面的微生物发生水合作用,从而加速了它们的死亡。所以在达到同样灭菌效果的前提下,湿热灭菌所需要的时间要短得多。

（公式F0=Ft*10(t-121)/10只适合于湿热灭菌,F0系T=121℃及Z=10℃下的FT值。如果把121℃理解为“标准状态”,那么F0可理解为“标准灭菌值”）

关键词：灭菌时间、湿热灭菌、干热灭菌发酵清道夫2007-11-0321:41问：验证是不是要3批样品的一次，还是一批样品的3次，还是3次样品3次得实验？

答：1、验证的目的，是要考察实验方法的可行性（避免出现假阳性、假阴性），

2、在样品的药物组成、成份、给药途径一致的前提下，验证时，“同一个批号的做3次”或“3个批号的各做一次”，均可。

关键词：验证、3次、1次发酵清道夫2007-11-0321:41问：集菌仪用的洗瓶如何灭菌？答：集菌仪用的洗瓶，胶塞扎入针头（顶部塞入适量脱脂棉）包纱布，再用一层牛皮纸包好用121度湿法灭菌30min。

关键词：洗瓶、针头、脱脂棉发酵清道夫2007-11-0321:41问：用薄膜过滤法做细菌及霉菌的阳性菌计数时用做平行吗？

答：需要做平行试验（2张薄膜）。

关键词：薄膜过滤法、阳性菌计数、平行试验发酵清道夫2007-11-0321:41问：做实验的好习惯是什么？

答：1.实验前后清洁洗手，完毕清理实验现场，器皿洗净归原，仪器等电源关闭。2.试剂、样品标签详细准确，包括剂量，规格，时间，实验人员等等；实验记录详细准确，以便备查和分析。3.提前分析实验内容及步骤，准备好全部的试剂及相应工具、仪器，不懂或者有疑问的步骤和地方问清楚，重点难点重点标出，做到心中有数；实验完毕及时分析。4.科学计划、合理分配时间，做到忙而不乱。实验中仔细观察试验过程，及时记录可疑或者需要注意的地方。5.多读文献多与别人交流，开拓思路，改进方案，对于实验的进展及方向做到一定的把握。

关键词：做实验、好习惯发酵清道夫2007-11-0321:42问：为什么二部附录中的无菌检查方法验证用菌种，将铜绿假单胞菌更换为大肠埃希菌？

答：这个问题，国家药典会的网站，已做说明。对于化学药的验证菌株，大肠埃希菌比铜绿假单胞菌，更敏感。

关键词：二部附录、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、敏感发酵清道夫2007-11-0321:42问：薄膜过滤法做三种控制菌，非要制备3张膜吗？

答：如果膜分成几份,必须保证每份所相当于取样量一定要符合规定，所以薄膜过滤法做三种控制菌，最好制备3张膜。

关键词：薄膜过滤法、控制菌发酵清道夫2007-11-0321:42问：限度检查所用器皿用自来水洗后一定用纯化水再洗吗?

答：GMP认证中关于QC的规程中"分析用玻璃器皿清洁规程"要求如下

目的提供玻璃器皿的清洁方法的文件指导。范围化验室部门所有玻璃器皿。责任化验室人员。程序4.1玻璃器皿每次使用后，使用者必须使其清洁并放于固定位置备用。4.2一般玻璃器皿清洁，用饮用水或去污剂洗涤后，器壁应不挂水珠，再用少量纯化水冲洗器皿三次，放固定位置自然干燥。4.3定量分析用玻璃器皿（如滴定管；移液管等）清洁，先把器皿内的水沥掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段时间，放掉洗液，用饮用水冲洗后，再用纯化水冲洗三次，倒置自然干燥。4.4水分测定用的玻璃器皿清洁过程同1或2，清洁后置于105~107℃烘箱内烘干。然后存放于干燥器中。

关键词：限度检查、器皿、纯化水发酵清道夫2007-11-0321:42问：洁净室甲醛气体熏蒸消毒验证方案是什么？答：1、甲醛消毒方法在所有的消毒液中甲醛最常用。当相对湿度在65%以上、温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好，但若采用过多的甲醛，会因聚合而析出白色粉未附在建筑物或设备表面。一般甲醛的消毒方法如下：A：消毒前先用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗房间建筑物和设备表面，然后用5%麝香草酚溶液喷酒或擦洗，静置1小时后，再用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗一次。B：计算体积（包括房间及风管体积），按10ml/m3的比例准备浓度为36%的甲醛溶液（甲醛密度为），按2~3g/m3的比例准备高锰酸钾溶液。C：在房间中放入试验装置，如不锈钢培养皿支架；直径90mm双碟玻璃培养皿；枯草杆菌试纸，每张试纸上枯草杆菌数量为1*106个，每个培养皿中放2张试纸，1张做无菌试验，1张做含菌数试验。培养皿的数量应根据房间面积确定。D：消毒流程：在不锈钢容器中加入高锰酸钾，用双层纱布盖住桶口，再倒入36%浓度的甲醛溶液甲醛气体扩散（约30min）启动空调器让甲醛气体循环（约20min）关闭通风系统，房间熏蒸消毒，不少于7hr房间排气，用新鲜空气置换（约2hr）开启空调系统用75%酒精喷酒环境。E：质监部门取样培养。判断标准：试纸内枯草杆菌数量小于1*103个为合格。F：取样后用丝绸沾0.1%的新洁尔灭溶液擦洗机器表面；用0.1%新洁尔灭溶液或1%GermWarfare溶液或75%酒精喷洒建筑物四周。0.1%新洁尔溶液与1%GermWarfare溶液溶液每月轮换一次。2、气体熏蒸灭菌后室内环境中残留量的测试用甲醛气体进行熏蒸灭菌后，需用全新空气换气若小时，由于甲醛的环境标准只有（1~2）*10-6，要使环境中的残留的甲醛浓度尽可能低至不致使人嗅出特殊气味（〈0.55*10-6〉，并对眼睛无刺激（〈1*10-6〉，然后根据测定的室内环境中甲醛残留量的结果，正确设定换气时间，以保证在达到作业环境中无菌的前提下，对人身心健康不致产生不良影响。（1）取样方法及取样量在各取样场所，用约30L的塑料袋收集室内空气，将袋内空气用吸收瓶、泵、气流计等组成的装置捕集至瓶内吸收液中（样本数应≧3）。（2）供试液的配制取0.5%硼酸溶液20ml作为吸收液，用溶液吸收法，以1L/min的速度分别让各取样场所的空气通过10min，然后将吸收液移至的容量瓶中，加水使成，即得。（3）试验操作A：取供试液至带栓试管中，加5mol/L的NaOH溶液及AHMT溶液，轻摇数次混匀后，室温放置20min。然后加KIO4溶液，摇2~5min至无气流生成为止；同时用水同法制成对照液，在波长550nm附近测最大吸光度。B：分别取甲醛标准液0、、、、，加水使成，然后按A操作，测定吸光度，制出甲醛浓度（ug/ml）与吸光度的关系检量线。环境中的甲醛浓度（10-6）可由下式求出：22.4273+t甲醛浓度（10-6）=aXX25X30.03273V式中a供试液中甲醛浓度，V采样气体量，Lt采样时平均温度，℃22．41mol气体在0、1个大气压（）下的体积，L；30．03甲醛相对分子质量；25供试液全量，ml。（4）试液准备A：甲醛标准液a甲醛稀释液：精取中国药典中规定“甲醛溶液”1ml,加水准确至200ml作为甲醛稀释液.精取10ml至碘瓶内，确加入碘液50ml，加1mol/L氢氧化锂溶液20ml。避光放置15min后，加15ml的10%硫酸，用硫代硫酸钠液（）滴定。另用水10ml进行空白试验。（Va-Vb）X1.5013甲醛稀释液中的甲醛浓度（mg/ml）=10式中Va甲醛稀释液消耗硫代硫酸钠液量，ml；Vb空白试验消耗硫代硫酸钠液量，ml；碘液（）相对甲醛的量，mg；10甲醛稀释液取样量，ml。b：甲醛标准液：精取甲醛稀释液，加水准确稀释1000倍，即得。B：AHMT溶液取4-氨基-3-肼-5-巯基-1，2，4-三唑，加盐酸100ml溶解，避光保存。需要说明的是，用甲醛消毒时也有不加高锰酸钾，而将甲醛直接放入空调器内送入房间及用氨水中和的方法。不管采用什么方法，只要经过验证是可行的，都可以使用。关键词：洁净室、甲醛气体、熏蒸消毒发酵清道夫2007-11-0321:43问：细菌室工作守则（微生物室SOP之一）是什么？

答：细菌室工作守则1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙醚和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。关键词：微生物室SOP发酵清道夫2007-11-0321:43问：紫外灯管是什么玻璃材料做的？原理是什么？

答：紫外线杀菌灯基本常识(彭海军)杀菌灯实际上是属于一种低压汞灯。低压汞灯是利用较低汞蒸汽压（<10-2Pa）被激化而发出紫外光，其发光谱线主要有两条：一条是波长；另一条是185nm波长，这两条都是肉眼看不见的紫外线。用来照明用的日光灯、节能灯也属于低压汞灯，依*低压汞蒸汽被激发后发射紫外线，其中254nm波长的紫外线照射到荧光粉上再发出可见光，如果改变荧光粉的成分和比例，它就可以发出我们通常所见的不同颜色的光。杀菌灯不需要转化为可见光，的波长就能起到很好的杀菌作用，这是因为细胞对光波的吸收谱线有一个规律，在250~270nm的紫外线有最大的吸收，被吸收的紫外线实际上作用于细胞遗传物质即DNA，它起到一种光化作用，紫外光子的能量被DNA中的碱基对吸收，引起遗传物质发生变异，使细菌当即死亡或不能繁殖后代，达到杀菌的目的。日光灯和节能灯使用普通玻璃做成的，紫外线透不出来，不能用做杀菌用的灯，石英玻璃对紫外线透过率高，达90%，是做杀菌灯的最佳材料，但是石英玻璃的性能与普通玻璃在性能上有很大的差别(主要是热膨胀系数不同)，封接不能用普通的自动化程度较高的圆封的办法，这使得杀菌灯生产制造的技术含量要高于普通节能灯。有一种透紫外线的玻璃，即通常所说的高硼玻璃，它对紫外透过率约是石英玻璃的60%，它的生产工艺与节能灯一样，使得它的成本与价格比石英玻璃生产的杀菌灯相差很远，几瓦的灯管只需几元，但它在性能上远比不上石英杀菌灯。表现在如下几方面：1、透过率不同，在同样规格经同样镇流器测试，石英玻璃杀菌灯紫外线强度是高硼玻璃杀菌灯的倍以上；2、高硼玻璃灯紫外光强度很容易衰减，它点灯数百小时后其紫外光强度就大幅下降，降到初始时的50%-70%。在用户手上，虽然看到灯管还是亮的，但它可能已不起作用了。而石英玻璃的光衰减程度要远小于高硼灯，如果生产工艺过关，石英灯的光衰减在经点灯2000-3000小时，光衰减到初始时的80%-70%，以后只要灯不灭，光衰的幅度会越来越小。国内杀菌灯的客户可能会了解菲利浦的杀菌灯，菲利浦有一种杀菌灯是用一种接近普通玻璃的玻璃生产的，而非石英玻璃制造的，其透光率接近石英玻璃的透过率，比中国的高硼玻璃灯要高得多，可使用自动化程度较高的节能灯生产工艺生产，这种灯主要依*他们炼制这种玻璃的技术。它的缺点是不能产生臭氧。石英杀菌灯的另一个特点是可发出臭氧。由于石英玻璃对短波185nm的紫外线透过率也高，185nm的紫外线能电离空气产生臭氧，臭氧浓度高对人体不利，但在无人场合时能使用，臭氧也能杀菌、消毒，恰好可弥补由于紫外线只沿直线传播、消毒有死角的缺点。有些场合不能有臭氧，也可使用石英杀菌灯，这种石英玻璃在炼制的时候就加了一种元素--钛（Ti），使它透过紫外线在200nm以下发生截止，而对254nm紫外线透过基本无影响，即通常所说的无臭氧杀菌灯。从以上分析，做杀菌灯用石英玻璃是最佳选择。在国内，医疗卫生领域，早已不推荐使用高硼杀菌灯，在美国、加拿大、日本生产紫外线杀菌灯普遍都采用石英玻璃。原理：现代紫外消毒技术是基于现代防疫学、光学、数学、生物学及物理化学的基础上，利用特殊设计的高效率、高强度和长寿命的C波段紫外光发生装置产生的强紫外C光照射流水、空气或固体表面，当水、空气或固体表面中的各种细菌、病毒、寄生虫、水藻以及其他病原体受到一定剂量的紫外C光辐射后，其细胞中的DNA结构受到破坏（键断裂，或光化学反应，如使DNA中THYMINE二聚等），从而在不使用任何化学药物的情况下杀灭细菌、病毒以及其它致病体。达到了消毒和净化的目的。

关键词：紫外灯管发酵清道夫2007-11-0321:43问：手部受伤能工作吗?答：细菌感染（局部化脓等现象，严重可引发全神感染），建议暂停工作。

关键词：手部受伤发酵清道夫2007-11-0321:43问：生孢梭菌可以用硫乙醇酸盐液体培养基进行保存吗？

答：生孢梭菌，可以短时间保存在硫乙醇酸盐液体培养基；长时间保存在疱肉培养基。

关键词：生孢梭菌、保存发酵清道夫2007-11-0321:43问：药品本身带很多菌,影响验证,怎么办?答：样品放到很烫的稀释剂里,若无效，采取高压湿热灭菌。

关键词：药品本身、很多菌、影响验证发酵清道夫2007-11-0321:44问:直接接种法和薄膜过滤法的区别

答:直接接种法取样量少,方法繁琐,且易受外源性细菌污染,对操作者和操作环境要求高,对实验结果的可*性影响较大。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法,具有代表性,不易漏检,仪器操作简单。该系统是全封闭过滤系统,避免了操作过程中外源性细菌的污染,对实验结果的可*性影响较小。薄膜过滤法的缺限是集菌仪的价格较高,一次性使用的集菌培养器也是一项支出,所以较直接接种法而言,花费的成本要高。相对产品质量而言,增加这点投入也是应该的。

关键词:直接接种法薄膜过滤法区别发酵清道夫2007-11-0321:44问:如何判断在何种情况下需要做微生物限度检查?

答:在附录制剂通则项下和正文中都没有明确要求做微生物限度检查的剂型不需要做,在附录制剂通则项下或正文中要求做的品种必须做

关键词:微生物限度检查发酵清道夫2007-11-0321:44问:无菌检查和微生物限度检查用超净台沉降菌和房间多长时间测一次洁净度?

答:静态检测一月一次，动态检测可在实验时同时进行，以及时了解空调系统、消毒效果和人员对环境是否有大的影响。

关键词:超净台洁净检测

引用:发酵清道夫2007-11-0321:44问:05版药典关于微生物限度检查验证方法中提到验证试验至少应进行3次“独立的平行试验”。请问应该如何理解“独立的平行试验”？什么样的情况算是“独立平行”呢？如果设计3次试验，试验时间能否重叠？试验条件能否共用？

答:时间可以重叠,试验条件也可以共用.先做一次独立的试验,然后后面两次跟第一次一样.(1）试验组：取样品加入xxxml稀释液中，混匀制成供试液，取供试液1ml和1ml50～100cfu试验菌，注入无菌平皿中，做2个平行。（2）菌液组：取1ml试验菌注入无菌平皿中，做2个平行，测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取1ml供试液注入无菌平皿中，做2个平行，测定供试品本底菌数。（４）倾注已融化并冷却至45℃左右的xxx培养基于以上平皿中，待凝固后，倒置于xxxx℃培养xxxh，计数。（５）试验重复３次。

关键词:独立的平行试验微生物限度检查验证发酵清道夫2007-11-0321:44问:HPMC(羟丙基甲基纤维素)的微生物限度试验,请问应采用膜过滤法还是平皿法?

答:目前，在欧洲和美国，普遍采用膜过滤法对液体样品和可溶性产品的微生物检验，另外FDA、EPA等权威机构也都将这种膜过滤法作为微生物检验的主要方法。药典要求一小时内将样品溶解,hpmc样品可以通过改变稀释倍数进行处理,比如取5g加200ml稀释剂，只要加样量为1g就可以了.

关键词:难溶样品发酵清道夫2007-11-0321:44问:菌种用20%甘油保藏，由于当时没有找到-80度冰箱，先在-20度冰箱保藏，但是转到-80度冰箱时，发现管内液体不是呈现固体冰的现象。是甘油与水没完全混匀的缘故吗?如果甘油浓度过高会有影响吗？

答:液氮保存是菌悬液和甘油1:1配比的(甘油50%),20%没有问题.液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

关键词:菌种保藏液氮冷冻保藏法发酵清道夫2007-11-0321:45问:分离的细菌如何鉴定?

答:细菌的传统鉴定1.形态特征及染色结果①革兰氏染色②鞭毛染色③荚膜染色④细胞壁染色（NaCl法：1.取1d25%NaCl溶液于洁净的载玻片上。2.挑一环培养6h的细菌在25%的NaCl中涂匀，自然凉干。3.滴加0.01%的结晶紫于其上，30s后水洗干燥，油镜观察。）⑤抗酸染色2.培养特征观察取菌龄24-28h的菌接种于PDA平板，PDA斜面，营养肉汤中培养24h，进行琼脂柱，明胶穿刺培养，30℃培养24h。3.生理生化实验需氧性测定和运动性测定：将斜面培养24h的待测菌用接种针穿刺到培养基管底，3d后观察变化。如果菌落沿培养基表面生长，表明为好氧菌，反应为阳性，如果菌落沿穿刺线生长，反应为阴性。培养基成分：蛋白胨，，，琼脂，葡萄糖，水100ml。4.生长温度测定在肉汤培养基（外加1%葡萄糖）中用接种针接种，在恒温水浴锅中不同温度下（4℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃）下培养2-5d观察生长情况，测定OD值，做温度曲线，确定最适生长温度，最高生长温度和最低生长温度。5.PH测定在肉汤培养基（外加1%葡萄糖）中分别用HCl，NaOH调，，，，，，，吸取定量的24h培养汤28℃培养24h，测培养液的OD值，做PH曲线。6.耐盐实验采用PDA液体培养基，分别加入NaCl，分别配成0%，5%，7%，10%的系列浓度，采用直针接种，28℃培养7d，在第三天和第七天各观察一次菌株生长情况。7.采用西蒙斯氏柠檬酸盐培养基（，，（NH4），柠檬酸酸钠，琼脂，蒸馏水100ml，溴百里酚兰少量，斜面接种并设空白对照，28℃培养7d，观察显色情况。8.接触酶试验将待测菌菌株在PDA斜面上28℃培养24h，滴入10%H2O2，观察有无气泡产生。9.脲酶试验将待测菌接种于PDA斜面，在3，7天进行脲酶产生测定。方法：在空试管中，将斜面菌台做成菌悬液，加一滴酚红指示剂，调PH到7，即酚红刚刚转黄呈橙黄色，再将此菌液分做2份，在其中一管中加入少量的晶体尿素（约），另一管不加尿素作对照，观察显色情况。10.糖，醇类发酵试验培养基：（NH4），，酵母浸膏，琼脂，葡萄糖，水100ml。秀甲酚紫少许中加入1%甘油，木糖，三梨醇，蔗糖，甘露醇，阿拉伯糖代替葡萄糖。将斜面培养24h的待测菌穿刺到上述培养基上培养5d，观察培养基的变化情况。试验于液体培养基（蛋白胨，葡萄糖，，蒸馏水100ml，）中接种待测菌菌株，2d后取出培养液和40%NaOH等体积混合，加入少量肌酸猛烈震荡3Min后，观察培养液的颜色变化。12.硝酸盐还原试验将待测菌接种于硝酸盐液体培养基（肉汁胨培养基1000ml，KNO310g，）2管做空白对照，培养2d后，取2支干净的空试管倒入少许培养液，各滴入1dA液（对氨基苯磺酸，10%稀醋酸150ml）及B液（ā-萘胺0.1%，蒸馏水20ml，10%稀醋酸150ml）对照管中同样加入A，B液各一滴，观察颜色变化。13.淀粉水解将培养基（肉汁胨中加入2%的可溶性淀粉）倒成平板，倒置过夜后，接种新鲜的菌种，28℃培养48h，待形成菌落后，滴加2滴碘液于菌落周围，观察菌落周围培养基颜色的变化。14.明胶液化培养基（蛋白胨，明胶10-15g，蒸馏水100ml，）取24h培养菌穿刺接种，设空白对照于20℃培养箱中培养，观察明胶的液化情况。试验产生试验培养基（蛋白胨1g，，牛肉膏，明胶10-12g，FeCl2微量，水100g，）穿刺接种，30℃培养观察培养基的颜色变化。16.M.R.试验（甲基红）培养基（蛋白胨，葡萄糖，，水100ml，）接种待测菌菌株于培养基中30℃培养6天，在培养液中加入一滴甲基红试剂，观察颜色变化。17.纤维素分解实验采用蛋白胨液体培养基接种待测菌，同时浸泡一条灭菌的优质新化滤纸，观察1-4周滤纸片的变化情况。

关键词：细菌鉴定发酵清道夫2007-11-0321:45问：什