比色法测定甘草中总皂苷的含量

比色法测定甘草中总皂苷的含量【摘要】目的建立甘草中甘草总皂苷含量的测定方法。方法用香草醛高氯酸试剂，在589nm处有最大吸收，并对比色条件进行了优化。结果该法精密度高，1h内稳定，平均加样回收率为99.03%。结论此法简便、准确、稳定性、重复性好，可用于甘草总皂苷的测底。【关键词】甘草；总皂苷；香草醛高氯酸DeterminationofTotalSaponinsinGlycyrrhizabyColorimetryAbstract:ObjectiveToestablishthemethodofdeterminationoftotalsaponinsinGlycyrrhiza.MethodsUseVanillinmaximumabsorptionatthewavelengthof589nm.Choosethebestchromogenicpreparationtodeterminethecontentsofthesamples.ResultsTheprecisionofthemethodishigh.Thecolorofthetreatedsampleswasstablewithin1h.Theaveragevalueoftherecoverywas99.03%.ConclusionThemethodissimple,accurate,highlysensitiveandreproducible.ItmaybeusedforthequantitativedeterminationoftotalsaponinsinGlycyrrhiza.Keywords:Glycyrrhiza;Totalsaponins;Vanillin-HClO4甘草为豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza）植物，为我国重要的传统中草药。甘草属植物在世界上共有30余种，我国有8种，分布在内蒙、西北、东北等地。目前，被《中国药典》认定的甘草药材原植物有3种［1］，即乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的根及根茎。其中以乌拉尔甘草分布最广，产量最多，质量最好。研究发现甘草属植物中三萜类皂苷具有含量高、生理活性强的特点，不仅具有抗溃疡、消炎、解毒等生理活性，今年研究还发现具有抗病毒、抗癌活性。皂苷定量分析方法的研究已有很多报道］27］，包括重量法、比色法、薄层扫描法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等。重量法具有测定值稳定、重现性好等特点，但分析流程时间长，操作繁琐，试剂消耗量大，得到的皂苷中一般混有一定量的杂质，使结果偏高，误差较大。比色法一般采用香草醛-硫酸比色法［ 2］。张中伟发现香草醛-硫酸法稳定性差，而香草醛高氯酸作为三萜皂苷常用的显色剂，较香草醛 硫酸的精密度高，且受糖类干扰较小［6］。薄层扫描法和高效液相法对测定样品、设备要求较高，且只适合一些特定皂苷的测定。综合考虑，以香草醛高氯酸作为显色剂，测定甘草中总皂苷的含量，建立一种简便、准确的方法。1器材1.1仪器721型分光光度计，上海分析仪器厂；KQ型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；AB204型分析天平，METTLER公司；紫外扫描分光光度计，岛津UV。1.2试剂高氯酸，甲醇，香草醛，冰醋酸（以上试剂均为分析纯），甘草酸单铵盐标准品（甘草酸单铵盐10mg溶解于甲醇中定容至10ml，浓度为1mgml-1,甘草（购于黑龙江省大庆市大同区）。2方法2.1最大波长的确定准确吸取0.5ml标准品溶液，置于10ml具塞试管中，70C水浴挥干溶剂，加入0.2ml的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入 0.8ml的高氯酸，摇匀，于55C水浴中加热20min，立即取出用流水冷却全室温，加入冰醋酸 5ml稀释，摇匀，以不加标准品的样品管为空白，于 400700nm波长处进行扫描。2.2比色条件的优化2.2.1最佳显色时间的确定取5份0.2ml对照品溶液，分别置具塞试管中， 70C水浴挥干溶剂，各加入0.2ml的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8ml的高氯酸，摇匀，于60C水浴中加热不同时间(5,10,15,20,25min)，立即取出用冷水冷却全室温，加入冰醋酸5ml，摇匀，于最大吸收波长处测定其吸收值。2.2.2最佳显色温度的确定分别取5份0.2ml对照品溶液，依上法操作，在不同温度(50,55,60,65,70C)水浴20min，同上进行测定。2.3显色稳定性的考察精确吸取标准样溶液0.2ml，按2.1中的香草醛-高氯酸法显色，在1h内，每隔5min测定吸收值的变化情况。2.4标准曲线绘制精确吸取标准液0.1，0.15，0.2，0.25，0.3ml分别置于10ml具塞试管中，按2.1中的香草醛-高氯酸法显色后测定吸光值，每个浓度平行测定 3次，以皂苷的质量为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到回归方程。2.5样品待测液的制备准确称取脱脂后的甘草粉0.2g(40目)于10ml具塞试管中，准确加入甲醇4ml(含1%氨水)，加塞后放入超声波清洗器中超声 1h，然后取出试管置于离心机中以3000rmin-1离心15min，上清液作为待测液。2.6精密度的测定准确吸取待测液 60妙16份，按2.1中的香草醛一高氯酸法显色后测定吸收值。2.7加标回收率实验准确量取 6份已知浓度的供试样品 25P,1再分别加入标准溶液30口，1按2.1中的香草醛-高氯酸法显色后测定吸收值， 计算加标回收率。2.8样品的测定吸取上述2.5项下提取纯化的3种样品溶液各60□胺2.1中的香草醛一高氯酸法显色后测定吸收值，根据工作曲线计算皂苷含量。3结果与讨论3.1最大波长的确定香草醛一高氯酸是常用的一类显色剂，显色灵敏度高，试剂空白溶液色浅，常用作三萜皂苷的显色剂。其反应机理可能是皂苷在强氧化性酸的作用下脱氢，氧化后再与香草醛加成。显色后，香草醛一高氯酸能与皂苷反应形成特征的紫红色。扫描结果表明，甘草酸单铵盐标准品溶液在589nm处有最大吸收，故选取589nm为测定波长。3.2比色条件的确定3.2.1最佳显色时间的确定结果见图 1。3.2.2最佳显色温度的确定结果见图 2。3.3显色的稳定性显色反应的 1h内试样的吸光值下降较小( CV=0.68%)，在1h内测定的数据是基本稳定的，可以满足测定的要求。3.4标准曲线回归曲线数据见表1。表1测定的回归曲线数据(略)以3次测定的吸光值的平均值A为纵坐标，以甘草酸单铵盐量/mg为横坐标，绘制成标准曲线，如图3所示，该标准曲线的回归方程0为：y=2.3343x-0.0011 ，r=0.99963.5样品待测液的制备测定样品皂苷含量一般采用索氏抽提的方法，这种制备样品方法既繁琐、费时，又难以抽提完全，不能满足样品批量测定制样的要求。吉宏武［ 8］发现20倍的甲醇超声波提取1h可将材料中的皂苷提取完全。由于甘草酸在甘草皂苷中所占比例最大,且在甘草中以钠盐或钾盐的形式存在 ，加入稀氨水(0.5%5%)，则可与甘草酸形成铵盐而增加其水溶性，使提取效率提高。稀醇(甲醇或乙醇50%70%)溶液对皂苷的溶解性较好，对植物细胞组织的穿透性也较强，多糖、蛋白质等在醇溶液中易产生沉淀 ，因此提取液的杂质较少［9］,所以在选用样品的提取溶剂时采用甲醇 (含1%氨水)。在对样品测定之前要脱脂，否则对香草酸-高氯酸比色体系干扰较大。3.6精密度的测定结果见表2。表2精密度实验结果(略)3.7加标回收率实验结果如表3。表3加标回收率实验结果(略)平均回收率X=99.03%，测定的标准差S=5.08,CV=5.13%表明皂苷在提取、纯化过程中没有损失，可以保证最终测定结果的可靠性。3.8样品的测定结果见表4。表4样品总皂苷的测定含量(略)本方法测定的皂苷含量为5.16%，与谢彦报道的含量范围(5%11%)一致［9］。采用香草醛高氯酸比色法对甘草皂苷进行定量测定时，显色反应过程中吸光度随加热时间和温度的改变而变化，测定时要严格按照操作步骤。另外，所用的香草醛 冰乙酸溶液要在用时现配，否则空白值的颜色会加深，影响测定的结果。【参考文献】：1］谢彦，徐淑永，曾和平.甘草属植物中三萜类化合物研究概述］J］•广州化学，2004，32(1):1.［2］陆蕴如，邵爱新.用香草醛 硫酸比色法测定次片甘草及蜜灸甘草中甘草酸的含量］J］.药物分析杂志，1981,1(2):84.：3］刘冈匚薄层分离紫外分光光度法测定甘草浸膏中甘草酸的含量】 J］.宁夏大学学报，1990，11(4):38.［4］ 张继，杨永利，王莱.双波长薄层扫描法测定乌拉尔甘草中甘草酸含量［J］.西北师范大学学报，1998，34(1):66.［5］ 梁月琴，刘琴，吴德政.用高效液相色谱法测定甘草及其制剂中甘草酸含量:J］•军事医学科学院院刊，1997,21(3):55.：6］张中伟，谢明勇，王远兴，等比色法测定苦瓜总皂苷］ J］.南昌