微生物计数法

中药制剂分析技术微生物计数法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine1.各种非无菌制剂及其原、辅料应进行微生物限度检查；2.药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原辅料、原料、辅料及其他品种均应进行无菌检查。3.微生物限度检查法系指用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合相应微生物限度标准的方法。（一）《中国药典》的相关规定微生物计数法一、基本知识

微生物计数法需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌检查法耐胆盐格兰阴性菌大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌（二）微生物限度检查项目（三）微生物计数法1.微生物计数法——系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。2.适用范围：——非无菌制剂及其原、辅料。——除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査二、微生物限度检验原则（一）环境要求应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行；检验过程严格遵守无菌操作，严防第二次污染。单向流空气区域/工作台面及环境应定期进行监测。（二）供试品抽样、保存及检验量1.抽样按批号随机抽样，抽样量为检验用量的3倍。每批抽样应至少含有2个以上最小包装单位。2.保存供试品在检验前不得任意开启，以防再污染。所需样品必须保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防原染菌状况发生变化。（二）供试品抽样、保存及检验量3.检验量检验量系指一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2

(不得少于4片)。贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml蜜丸不得少于4丸，膜剂不得少于4片。（三）供试液制备采用规定的适宜方法制备1．水溶性供试品若需要，可调节供试液pH至6～8必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液或pH值7.2磷酸盐缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1:10供试液水溶性供试品2．水不溶性非油脂类供试品：或pH值7.2磷酸盐缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1:10供试液水不溶性非油脂类供试品必要时，加表面活性剂（0.1%聚山梨酯80），使供试品分散均匀若需要，可调节供试液pH至6～8必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释3．油脂类供试品：

或最小量无菌聚山梨酯或其他适宜的表面活性剂无菌十四烷酸异丙酯1:10供试液油脂类供试品表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃）可进一步10倍系列稀释4．需用特殊方法制备的供试品膜剂供试品肠溶或结肠溶制剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品贴膏剂供试品其制备方法按药典规定操作5.具抑菌活性供试品：消除抑菌活性可采用增加稀释液或培养基体积薄膜过滤法加入适宜的中和或灭活剂以上几法联用（四）检验条件培养温度：需氧菌培养温度为30～35℃霉菌、酵母菌培养温度为20～25℃三、需氧菌、霉菌及酵母菌计数（一）计数培养基的适用性检查（二）计数方法的验证（三）检查方法（四）注意事项

（一）计数培养基的适用性检查基本知识计数用培养基：胰酪大豆胨琼脂（或液体）培养基、沙氏葡萄糖琼脂（或液体）培养基、马铃薯葡萄糖培养基对照培养基：系指培养基处方特别制备、质量优良的培养基，由中国药品生物制品鉴定所研制及分发。检查方法：通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价检验用培养基是否符合检验要求。（一）计数培养基的适用性检查1.菌种（5种）传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus）枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)白色念珠菌(Candidaalbicans)黑曲霉(Aspergillusniger)（一）计数培养基的适用性检查铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基白色念珠菌黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养基白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨琼脂培养基需氧菌计数用培养基适用性检查霉菌、酵母菌计数用培养基适用性检查2.菌液制备接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨或胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖琼脂液体培养基中，20～25℃培养2～3天。上述培养基用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。2.菌液制备接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液。菌液保存

制备好的菌液以当天使用为宜。若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。3.适用性检查取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨（或液体）培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养，前三种不超过3天，后两种菌不超过5天，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～25℃培养72小时，计数；用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。4.结果判断同时满足以下两个条件可判定培养基的适用性检查符合规定：②被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。①被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；（二）计数方法的验证1.菌种与菌液的制备同培养基的适用性检查2.验证方法

验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率；可与供试品的需氧菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。2.验证方法(1)试验组：1ml最低稀释级供试液+不大于100cfu试验菌(2)菌液组：1ml稀释液+不大于100cfu试验菌(3)供试品对照组：规定量的供试液+1ml稀释液注意：（1）若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。（2）如果无法以其他方法消除供试品对微生物生长的抑制作用，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。3.结果判断计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5〜2范围内；采用MPN法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。（三）检查方法：平皿法薄膜过滤法最可能数法1.平皿法适用于无明显抑菌作用的制剂注意：（1）平皿法计数时还需做阴性对照，要求均不得有菌生长。（2）每稀释级每种培养基至少制备2个平板倾注法供试液倾注培养基培养及计数菌落报告取1ml置平皿体积15～20ml温度不超过45℃需氧菌3～5天霉菌、酵母菌5～7天涂布法培养基注入平皿使培养基干燥培养及计数菌落报告制成平板体积15～20ml温度不超过45℃需氧菌3～5天霉菌、酵母菌5～7天接种若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。菌数报告规则：宜选取需氧菌平均菌落数小于300cfu、霉菌平均菌落数在小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2.薄膜过滤法一般适用于可溶性抑菌制剂滤膜：孔径≤0.45μm，直径一般为50mm；每张滤膜冲洗量为100ml/次，总滤过量≤1000ml/张操作流程：供试液过滤冲洗滤膜的菌面朝上贴于培养基培养和计数取出滤膜规定：每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告原则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数。若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数(每张滤膜滤过1g或1ml供试品)，或以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

阴性对照：取试验用的稀释剂1ml同法操作。阴性对照不得有菌生长。3.MPN法(最可能数法)仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。(1)供试液检测取供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份，每1ml分别接种至3管装有9〜10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。(2)培养和计数

所有试验管在30〜35℃试验培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。记录每一稀释级微生物生长的管数，査表可知每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。（四）注意事项1.所测菌只包括一群能在上述培养基上生长的嗜中温