h9n2亚型禽流感分离鉴定

H9N2亚型禽流感病毒的检测、分离与鉴定姓名：刘**专业：动医10-2班

目前一页\总数二十一页\编于十三点研究背景研究目的与意义研究技术路线结果结论概要目前二页\总数二十一页\编于十三点一、研究背景

2012年4月13日，山东省青岛某大型养鸡厂出现一批疑似感染H9N2亚型禽流感病毒的病（死）鸡，临床上表现为精神沉郁，采食量下降，呼吸困难，个别病鸡出现腹泻症状

，产蛋量下降。目前三页\总数二十一页\编于十三点临床剖检气管出血目前四页\总数二十一页\编于十三点肠道、胰腺出血目前五页\总数二十一页\编于十三点腺胃乳头出血目前六页\总数二十一页\编于十三点肾脏肿胀、出血

目前七页\总数二十一页\编于十三点二、研究目的与意义对送检病料进行实验室检查，确定该鸡群发病的原因。对H9N2亚型禽流感病毒进行分离鉴定，为以后分子水平的研究打下基础。目前八页\总数二十一页\编于十三点临床剖检疑似病例病料的RT-PCR检测鸡胚接种尿囊液检测尿囊液HA、HI检测尿囊液RT-PCR检测三、研究技术路线目前九页\总数二十一页\编于十三点1、病料的采集处理2、病毒RNA的提取3、病毒cDNA的获取

4、基因的RT-PCR扩增5、电泳

1.病料RT-PCR检测目前十页\总数二十一页\编于十三点选取经PCR初步检测后的阳性病料，三次反复冻融后3000rpm离心5min，过滤后接种9-11日龄SPF鸡胚（0.2ml/枚）。37℃下孵育72h，弃去24h内死胚，将24-72h内死亡和存活鸡胚置4℃，无菌收获尿囊液。2.鸡胚培养目前十一页\总数二十一页\编于十三点3.尿囊液检测（1）接种鸡胚血凝试验（HA）测定

在96孔微量血凝板上，每孔加25μl生理盐水。每行的第1孔加入25μl尿囊液，充分混匀后吸取25μl加入第2孔，如此倍比稀释至第11孔，从第11孔中吸弃25μl，第12孔不加尿囊液，作为阴性对照孔。每孔内再加1%鸡红细胞悬液25μl，振荡混匀，于室温静置30min，观察结果。目前十二页\总数二十一页\编于十三点HA结果判定：

结果以++++、+++、++、+和－表示。判定以++为终点，亦即一个血凝单位。依此标准判定：能凝集红细胞的最大稀释度即是病毒的血凝价，即HA价。目前十三页\总数二十一页\编于十三点（2）接种鸡胚血凝抑制试验（HI）测定

96孔微量血凝板的第1、2行的各孔内依次加入25μL生理盐水。于第1行的第1孔内均加入25μLH9N2阳性血清，充分混匀后吸取25μL加入第2孔，如此倍比稀释至第11孔，从第11孔吸出25μL液体，弃去。最后一孔加入25μLH9N2阳性血清。于血凝板的第二行各孔内重复上述操作，只是将H9N2血清样本换做新城疫血清样本。在这两行的各孔内均加入25μL4个血凝单位抗原。轻轻摇匀后，放入37℃电热恒温培养箱静置15min后，各孔均加入25μL1%鸡红细胞悬液。振荡混匀，于37℃电热恒温培养箱静置15min后，观察结果。目前十四页\总数二十一页\编于十三点HI结果判定：

结果以++++、+++、++、+和－表示。结果判定以++为终点。依此标准判定：以能够抑制病毒凝集红细胞的最大血清稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。判定HI效价大于或等于8的血清样本为病毒抗体阳性。目前十五页\总数二十一页\编于十三点（3）鸡胚尿囊液的RT-PCR测定

取尿囊液按常规方法进行H9N2亚型禽流感（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、呼肠孤病毒(REOV)、马立克病毒（MDV）、网状内皮组织增殖病毒（REV）、鸡传染性贫血病毒（CAV）及法氏囊病毒（IBDV）的RT-PCR检测。目前十六页\总数二十一页\编于十三点1、病料RT-PCR扩增结果M为DLDNA2000Marker1为病鸡肺、气管的研磨液，用的是扩增H9N2亚型AIV的引物2为病鸡肝的研磨液，用的是扩增H9N亚型AIV的引物3为H9N2的阳性对照4为病鸡肝的研磨液，用的是扩增NDV的引物5为病鸡肺、气管的研磨液用的是扩增IBV的引物6、7为空白孔四、结果目前十七页\总数二十一页\编于十三点

SPF鸡胚接种病料后的胚体病变

2、接种鸡胚的病变情况目前十八页\总数二十一页\编于十三点3.尿囊液检测结果（1）HA测定结果H9N2分离株的鸡胚尿囊液能使鸡外周血红细胞发生凝集，HA为210，反应呈强阳性。由于传染性支气管炎不能使鸡外周血红细胞发生凝集，故可以排除尿囊液中不含有传染性支气管炎病毒。目前十九页\总数二十一页\编于十三点其中加入NDV阳性血清的尿囊液能使鸡外周血红细胞全部发生凝集，反应呈阴性加入H9N2阳性血清后，尿囊液能使部分鸡外周血红细胞发生凝集，反应呈阳性，HI为28（2）HI测定结果目前二十页\总数二十一页\编于十三点（3）尿囊液的RT-PCR测定M：DLDNA2000Marker1：H9N2亚型禽流感（AIV）2：传染性支气管炎（IBV）3：新城疫病毒（N