Section1中心法则面临的挑战

蛋白质研究领域的发展特点发展飞速、学科交叉一、中心法则面临的补充和挑战二、新生肽链的成熟和周转三、蛋白质研究相关技术目前一页\总数四十二页\编于十六点Section1中心法则面临的补充和挑战目前二页\总数四十二页\编于十六点1958年Crick首次提出中心法则之后，始终在不断的补充和完善。但是20世纪90年代后面临着一些新的挑战：1。生物体内存在不以DNA为模板的肽链合成；2。蛋白质的自剪接（蛋白质内含子问题）；3。蛋白质折叠需要分子伴侣；4。表观效应可以遗传目前三页\总数四十二页\编于十六点1.生物体内存在着不以DNA为模板的肽链合成生物体内肽类可以通过两种不同的途径合成，一是以DNA为模板的核糖体途径二是以多酶体系为模板的非核糖体合成方式。通过非核糖体途径合成的肽类包括：谷胱甘肽；胞壁质交联肽；多种抗生素多肽（如短杆菌肽S、放线菌素、多粘菌素、分枝杆菌素、缬氨霉素、鹅膏蕈碱、鬼笔毒环肽等）目前四页\总数四十二页\编于十六点

不同合成途径肽类的差别特征核糖体途径非核糖体途径大小大小不受限制2-50(一般4-10)氨基酸氨基酸组成常见氨基酸及其修饰物不同类型氨基酸和衍生物氨基酸构型几乎均为L-型常有D-型非氨基酸组分被酰化和脱羧成为胺类多种类型的衍生化环状结构很少见，有也是二硫键或硫脂酯键大部分为环状，环肽和内酯为主修饰情况羟化、脱氢、侧链环化等甲基化、糖基化、羟化、交联罕见结构尚未发现脂肽、聚酮类模板核酸多酶体系巯基模板机制生物合成核糖体合成非核糖体酶促反应合成分布各种动、植物，一些细菌主要为细菌、低等真菌目前五页\总数四十二页\编于十六点1.1合成短杆菌肽S的多酶体系：短杆菌肽S(GS)是由短杆菌BacillusBrevis产生的环十肽催化多酶体系结构：轻酶（lightenzyme,LE):100kDa，具消旋酶活性，使L-Phe活化、硫酯化后转变为D-Phe

重酶（heavyenzyme，HE)：280kDa，含4’-(p)-泛酰巯基乙胺蛋白[4’-(p)-pan，手臂]，具有转硫醇和转肽作用，可转移并延长肽链；此外，对Pro、Val、Orn、Leu有特异活化位点，可将其等比例排列、活化和硫酯化目前六页\总数四十二页\编于十六点合成步骤:LE：将L-Phe活化并转变为D-Phe（N-端第1个氨基酸），反应消耗ATP，需要Mg2+；

HE：消耗ATP，Mg2+,将Pro、Val、Orn、Leu活化和硫酯化,（分别为第2、3、4、5号氨基酸）；将LE上的D-Phe转移到HE的4’-(p)-pan蛋白上，起始肽链合成，并依次连接上其余4个硫脂化的氨基酸，形成5肽；形成的5肽被转移到HE的第6位存放；重复上述操作，再合成一个同样的5肽后，由4’-(p)-pan手臂将其转到第6位上的第一个5肽上，并首尾相连合成环十肽。说明：GS合成不是DNA编码，也没有RNA作为模板，而是多酶体系自身为模板合成的，酶对底物氨基酸的特定吸附顺序决定了肽的序列。目前七页\总数四十二页\编于十六点Surfantin：由枯草杆菌合成的表面活性肽，是由7个aa和-羟基脂肪酸连接构成的环状脂肽分子，具有抗菌和抗病毒能力，更是良好的表面活性剂。其合成多酶体系包括：A结构域：选择底物氨基酸并将其腺苷酰化，形成aa-AMPT结构域：巯基化结构域，结合磷酸泛酰巯基乙胺手臂C结构域：缩合结构域，催化肽键形成，以及脂与肽的缩合E结构域：差向异构结构域M结构域：N-甲基化结构域其它结构域：酰基化、糖基化、杂环化等修饰结构域1.2以非核糖体合成酶为模板合成Surfantin短肽因这些结构域的作用，产物中存在近300种稀有氨基酸基本模块目前八页\总数四十二页\编于十六点非核糖体合成酶（NRPS）合成Surfactin短肽示意图目前九页\总数四十二页\编于十六点1.3朊病毒蛋白质的畸变朊病毒作为病原体，提取物可通过100nm孔径的滤器，因此大小类属于病毒范围。朊病毒是不含核酸的蛋白侵染颗粒；其复制是在特定条件下（外来病源体；PrP基因突变等），PrPsc使正常PrPc蛋白分子畸变形成的，因此可以认为PrPsc蛋白具有“自我模板”功能；其它真核生物，如酿酒酵母的Sup35蛋白、Ure2蛋白以及鹅掌柄孢壳（Podosporaanserina）的Het-s蛋白等，都与朊病毒蛋白相似，具有类似的诱导其它蛋白转变成自身状态的模板功能。目前十页\总数四十二页\编于十六点2.蛋白质的自剪接（蛋白质内含子问题）1990年Hirata等首次发现酵母H+-ATPase亚基的蛋白质具有非酶促的自剪接现象（proteinself-splicing），可将119kDa的前体剪接为69kDa的ATPase亚基，中间被切除的50kDa内含肽具有核酸内切酶功能。目前已在多种蛋白质中发现存在内含子，但主要都存在古细菌、真细菌和单细胞真核生物中。内含肽（intein)：蛋白质中通过非酶促的自剪接去除的肽段部分。外显肽（extein)：蛋白质自剪接后保留的部分。目前十一页\总数四十二页\编于十六点2.1蛋白质中的内含肽：一般为300-550aa长度，少数较短，如gyrA的内含肽只有198aa；内含肽具有7或10个保守序列模块;一般N-端经常存在Cys、Ser和Tyr等带羟基或巯基的aa;C-端含有绝对保守的Asn-His二肽序列。内含肽随后的外显肽N-端，一般也是C、S、T（古细菌多为S和T，中等温度生长的生物以C为主）目前十二页\总数四十二页\编于十六点目前十三页\总数四十二页\编于十六点2.2内含肽切除示意：CSTHNC,S,T目前十四页\总数四十二页\编于十六点2.3内含肽去除的反应机制：目前十五页\总数四十二页\编于十六点2.4Hedgehog（Hh）自我水解反应Hedgehog（Hh）是胚胎发育过程中的重要信息分子（

1980年从果蝇体内分离的一种分节极性基因。其突变可使果蝇胚胎发育成毛团状，酷似刺猬而得名），成熟蛋白C-端带有胆固醇，并通过胆固醇维系在膜上。

Hh的N-端与一般内含肽的切除机制相同，通过S-O转酯形成硫脂；但C-端的连接由胆固醇代替，其羟基代替Cys的S原子与外显肽C-端羰基C连接，形成膜牵系的Hh蛋白。该过程同样是非酶催化的蛋白水解过程。目前十六页\总数四十二页\编于十六点2.5意义内含子的存在，使得DNA决定的mRNA前体与成熟mRNA不再一致；蛋白内含肽的发现，则使mRNA模板与成熟蛋白的结构不一致结果，使一个基因的产物，出现了多样化的结果，破除了以往认为真核生物“onegene，oneprotein”的观点，改变了遗传信息的共线性。是对中心法则，信息流向的重要补充和修正。目前十七页\总数四十二页\编于十六点3.蛋白质折叠需要分子伴侣

一级结构决定高级结构，该原则只给出了蛋白质折叠的热力学可能性，折叠动力学的实现需要分子伴侣帮助。3.1分子伴侣种类：#可被分为热激蛋白和环境胁迫蛋白两大类，因为它们的表达被各种胁迫所诱导；#根据分子量大小和分布：分为Hsp100-40以及小Hsp等#根据与核糖体关系：核糖体结合（包括引发因子和新生链相关复合物（nascentchain-assiociatedcompkex,NAC））及非核糖体结合分子伴侣目前十八页\总数四十二页\编于十六点目前十九页\总数四十二页\编于十六点

其它分子伴侣(plasmin)引发因子（triggerfactor,TF）结合于核糖体大亚基隧道出口，维持新生肽链构象

结合于核糖体目前二十页\总数四十二页\编于十六点非蛋白质/肽类分子伴侣：目前实验表明，除了常见的蛋白质或肽类分子伴侣外，还有有一些非蛋白质或肽类物质也可以帮助蛋白质折叠：例如：脂质和糖类。有报道，磷脂酰乙醇胺可以帮助大肠杆菌外膜中的乳糖通透酶的组装；磷脂、脂多糖，甚至磷脂和脂多糖的比例，都会影响到大肠杆菌外膜一组孔蛋白OmpA的组装和生物发生。流感病毒红细胞凝集素（HA）若失去N-糖链则不能正常折叠，也不能组装成三聚体和分泌到胞外；运铁蛋白受体（二聚体跨膜蛋白）每个亚基含3条糖链，Asn251突变被去糖基化后，则不能形成二聚体而影响受体功能。目前二十一页\总数四十二页\编于十六点3.2分子伴侣的功能3.2.1帮助新生肽链折叠：大肠杆菌中约有67%的蛋白质可以在细胞质中自发完成折叠，而其它蛋白质则必须借助各种分子伴侣的帮助。如：GroES/GroEL(Hsp60/Hsp10)；DnaK/DnaJ（Hsp70/Hsp40)等。并且不同的分子伴侣性质决定了蛋白质不同的折叠命运。目前二十二页\总数四十二页\编于十六点

不同分子伴侣的生化特性

决定了折叠肽链的命运目前二十三页\总数四十二页\编于十六点GroELGroESGroEL（HSP60）/GroES（Hsp10）目前二十四页\总数四十二页\编于十六点目前二十五页\总数四十二页\编于十六点3.2.2参与蛋白质亚基组装：叶绿体Rubisco、流感病毒红细胞凝集素组装等3.2.3参与蛋白质折叠的质量控制:

如内质网中的Bip/GRP78（Hsp70家族）、钙连蛋白和钙网蛋白等。目前二十六页\总数四十二页\编于十六点内质网内未折叠和错误折叠蛋白堆积，可引起相关应答，称为未折叠蛋白质应答（unfoldingproteinresponse，UPR），或者内质网应急（ERstress)。广义地理解，UPR包括3个方面：(1)加速新生肽链折叠，通过内质网分子伴侣，如Bip（内质网bindingprotein)、钙连蛋白和钙网蛋白等的协助。(2)通过内质网相关降解途径（ERAD）将未折叠或错误折叠的糖蛋白或其它蛋白从ER运出至胞质并降解。(3)反馈调节新生肽链的合成（主要是翻译）——主要议题3.2.4分子伴侣参与未折叠蛋白质应答：目前二十七页\总数四十二页\编于十六点反馈调节新生肽链的合成的中心环节是ER中的分子伴侣Bip：

Bip在ER中浓度高达100mg/ml，平时相当数量Bip是与ER上的蛋白结合的，包括：依赖肌醇的蛋白激酶/RNase（IRE-1）、激活转录因子6（ATF6）和蛋白激酶样内质网激酶（PERK）等。当大量新生肽链进入ER，需要更多Bip参与帮助折叠时，Bip就与上述蛋白解离。解离后的IRE-1和PERK二聚化，ATF6也发生构象变化。由此产生一些信号，转送到不同的细胞器，出现调节效应.目前二十八页\总数四十二页\编于十六点

ATF6进入高尔基体：经加工成为细胞质片段，后者进入细胞核，激活UPR有关基因。IRE-1二聚化：激活其蛋白激酶和RNase两种活性，一方面激活相应的蛋白质，另一方面对mRNA进行加工。PERK二聚化：其激酶活性因此被活化，可使得真核细胞起始因子2（eIF2）的亚基被磷酸化，影响40S起始三元复合物eIF2-GTP-tRNAMet的形成，降低肽链合成起始频率，抑制新生肽链合成。目前二十九页\总数四十二页\编于十六点内质网应急目前三十页\总数四十二页\编于十六点

原核及真核生物质量控制采用不同的方式目前三十一页\总数四十二页\编于十六点3.2.5分子伴侣兼有折叠酶活性：

PDI、PPI、TF（引发因子）具有PPI活性3.2.6分子伴侣参与信号转导：

Hsp70和DnaJ介导固醇类激素的信号转导。实质是两者与Hsp90等相互作用，帮助胆固醇激素受体折叠，或改变受体的构象。目前三十二页\总数四十二页\编于十六点4.表观效应可以遗传根据中心法则，基因决定性状，只有改变遗传信息才可能有遗传性状的改变，但近年来迅速发展起来的表观遗传学(epigenetic）却揭示：存在许多基因型未改变而改变了的表型，且这些表型可以遗传——表观遗传。表观遗传变异(epigeneticvariation)是指,在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。它是不符合孟德尔遗传规律的遗传方式。表观遗传变异的研究内容包括：基因沉默、DNA甲基化、核仁显性、休眠转座子激活、基因组印记等。目前三十三页\总数四十二页\编于十六点4.1X染色体失活：

在哺乳动物中,雌雄性个体X染色体的数目不同,这类动物需要以一种方式来解决X染色体剂量的差异。在雌性哺乳动物中,两条X染色体有一个是失活的,称为X染色体的剂量补偿(dosagecompensation)。X染色体失活的选择和起始发生在胚胎发育的早期,这个过程被X失活中心(X-inactivationcenter,Xic)所控制,是一种反义转录调控模式。这个失活中心存在着X染色体失活特异性转录基因Xist(X-inactive-specifictranscript),当失活的命令下达时,这个基因就会产生一个17kb不翻译的RNA与X染色体结合,引发失活。X失活中心还有“记数”的功能,即保持每个二倍体中仅有一条X染色体有活性,其余全部失活。目前三十四页\总数四十二页\编于十六点X染色体的失活状态需要表观遗传修饰如DNA甲基化来维持。这种失活可以通过有丝或减数分裂遗传给后代。X染色体失活是表观遗传学研究的很好范例,它能帮助人们认识基因沉默是如何建立和通过遗传而保持的。对于X染色体失活的研究还要特别关注于：哪些因素调控了Xic的功能、XistRNA造成沉默的机制和一些像BRCAl的蛋白质在X染色体失活中的作用等问题。

目前三十五页\总数四十二页\编于十六点4.2DNA甲基化引起的表观效应：甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段。在脊椎动物中,CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在,人们将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛(CpGisland),通常长度在1kb～2kb左右，常位于转录调控区附近。在DNA甲基化过程中,胞嘧啶突出于DNA双螺旋并进入与胞嘧啶甲基转移酶结合部位的裂隙中,该酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶的5′位,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5MC)。目前三十六页\总数四十二页\编于十六点体内甲基化状态有三种:持续的低甲基化状态：如持家基因；诱导的去甲基化状态：如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态：如女性的一条缢缩的X染色体。DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶家族(DNAmethyltransferase,Dnmt)来催化。DNA甲基转移酶有维持甲基化酶（Dnmtl）和重新甲基化酶（如Dnmt3a和Dnmt3b,它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化）两种。在细胞分化的过程中,基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。但在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞。目前三十七页\总数四十二页\编于十六点DNA甲基化影响到基因的表达,与肿瘤的发生密切相关。甲基化状态的改变是致癌作用的一个关键因素,它包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高,这将导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)。把癌基因组学与表观遗传学的研究结合起来,是癌症研究的发展趋势。目前三十八页\总数四十二页\编于十六点人类的一些癌症常出现整个基因组DNA的低甲基化，目前不能肯定这种表观遗传变化是肿瘤产生的诱因还是结果。研究者构建了携带低表达水平Dnmtl基因的小鼠，结果显示，DNA低甲基化可能通过提高染色体的不稳定性来促进肿瘤的形成；并且，通常使用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗人和小鼠的癌症，其疗效可能是由于这些抑制剂恢复了肿瘤抑制基因的活性。但是这种导致DNA低甲基化的治疗方式，可能在防止一