植物细胞组织培养的基本技术(总结版)

本章主要内容商业性组织培育试验室和小工厂的设计与主要设备培育基及其配制外植体的选择与培育第一节商业性组织培育试验室和小工厂试管苗的驯化与移载第一节商业性组织培育试验室和小工厂培育皿的清洗；

的设计与主要设备培育基的配制、分装和高压灭菌；无菌操作——材料的外表灭菌和接种；将培育物放到培育室培育；试管苗的驯化、移栽和初期治理。(一)、洗涤室(cleaningroom)洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、枯燥和贮存。室内配备：备有塑料筐，用于运输培育器皿。备有枯燥架，用于放置枯燥涮净的培育器皿。(二)、预备室(repairingroom)完成培育基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。预备室要求光明、通风。培育器皿的清洗工作；配置室则负责培育基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。(三)、缓冲室进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。掌握无菌室及培育室的配电板等。(四)、无菌操作室(transferingroom)接种室是进展植物材料的分别接种及培育物转移的一个重要操作室对组织培育成功与否起重要作用。配置：在工作便利的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以削减开关门时的空气扰动。1-2灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，削减与外界空气对流。(五)、培育室(culturingroom)培育室是将接种的材料进展培育生长的场所。培育室的大小可依据需要培育架的大小、数目、及其他附属设备而定。设计原则：充分利用空间和节约能源高度比培育架略高为宜四周墙壁要求有绝热防火的性能。(五)、培育室(culturingroom)培育架大多由金属制成。规格：510cm30cm1.7m右。培育架长度都是依据日光灯的长度而设计，如承受40W1.3m，30W1m60cm。培育室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或的培育室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。掌握日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培试验室大多设计好，驯化易成活。(六)、驯化室通风口以及必要的杀菌剂。(七)、温室应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿掌握装置、喷雾装置、光照调整装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具常见仪器设备1、超净台2、无菌箱3、空调机4、除湿机5、恒温箱6、烘箱7、高压灭菌锅8、冰箱9、电子分析天平和托盘天平10、显微镜及解剖镜11、水浴锅12、摇床与转床13、磁力搅拌器14、电蒸馏水器15、酸度计16、离心机1、超净台和无菌箱110分钟即可操作，可进展长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要常常长期地工作时，超净台是很抱负的设备。2、无菌箱，在投资少的状况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂工作原理超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这于0．3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最终以较干净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止四周空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不料在转移接种过程中不受污染。依据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。〔二〕各类玻璃器皿1、培育器皿2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、试验器皿1、培育器皿1、培育器皿：在组织培育中配制培育基和进展培育需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培育皿等使用较多。最常使用的是三角瓶培育皿〔9、12cm直径〕用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培育、看护培育、无菌种子的发芽、植物材料的分别等都需承受。试管〔18mmXl80mm或20mmX200mm〕用于：培育较高的试管苗。200ml生殖时操作便利、工作效率高，也削减了培育材料的损伤。但缺点是易引起污染。瓶口封塞衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济便利，且通气好。也可承受专用的封口膜。5、细菌过滤器用于除去不能承受湿热灭菌法的液体中的细菌。一般承受0.22um微孔滤膜进展抽滤灭菌。包括滤头，注射器或承受抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6、试验器皿在组织培育中配制培育基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学试验用的玻璃器皿，包括:100ml、250ml、500ml、1000mll0ml、l00ml、1000mll00ml、1000ml〔三、器械用具〔P13〕1．镊子类：尖头和枪形2．剪刀类3．解剖刀4．解剖针5、接种工具：接种针、接种钩及接种铲〔由白金丝或镍丝制成〕6、钻孔器7、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等其次节培育基及其配置目的要求：(1)一般把握培育基的种类、特点；(2)把握根本培育基的配方；(3)一般把握培育基的组成成分和适宜的剂量；(4)把握培育基母液和常用培育基的配制方法和步骤；(5)娴熟把握培育基的灭菌方法；(6)一般把握培育基的筛选方法。培育基及其配制培育基的种类培育基的成分培育基配制培育基的种类按成分分类:MS,B5,White,NT,KM-8P,N6按状态：液体，固体。MS〔MurashigeandSkoogMedium〕MS〔MurashigeandSkoogMedium〕ToshioMurashige,FolkeSkoog.ARevisedMediumforRapidGrowthandBioAssayswithTobaccoTissueCultures.Physiol.Plant.1962,15:473-497.植物组织培育中常用的一种培育基。离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培育基高。器官，花药，细胞，原生质体培育。B5〔B5Medium〕Gamborg,O.L.;Miller,R.A.;Ojima,K.Nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.Exp.CellRes.50:151–158;1968.B5〔B5Medium〕铵含量较低木本植物，十字花科植物White〔WhiteMedium〕White,P.R.Handbookofplanttissueculture.NewYork:TheRonaldPressCo.;1943.White,P.R.;Grove,A.R.Proceedings,InternationalConferenceonPlantTissueCulture(1963:UniversityPark,PA).Berkeley,CA:McCutchanPub.Corp.;1965:553pp.无机盐含量低生根培育NT〔NTMedium〕1970烟草叶肉原生质体培育KM-8〔KM-8Medium〕1974有机成分简单，包括全部单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸原生质体和融合体培育N6〔N6Medium〕1974，朱至清等。成分简洁，KNO3〔NH4〕2SO4小麦，水稻及其他植物花药培育和组织培育培育基的成分水无机养分成分有机养分成分植物生长调整剂附加成分水培育基的主要组分缺少的物质。变质。大规模生产时可用自来水。无机养分组分作用满足植物对各矿质元素的需求。大量元素，6微量元素，7非必需元素，6铁承受螯合铁，FeSO4加EDTA有机养分成分碳源蔗糖维生素类硫胺素B，烟酸B，吡哆醇B，泛酸钙B5，肌醇。氨基酸蛋白质组成成分，促进细胞生长。其他有机附加物椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。椰子汁椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种自然复合物。一般使用浓度在10%-20%。它在愈伤组织和细胞培育中有促进作用。马铃薯去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到强健的植株。其他酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。植物生长调整物质生长素细胞分裂素赤霉素乙烯生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑脱落酸﹑乙烯-------植物激素“五兄弟”生长素〔auxin〕的觉察向光性：在单侧光的照耀下，植物朝向光源方向生长的现象。1、19(C.R.Darwin)试验试验材料：胚芽鞘总结上述三个试验,达尔文提出:胚芽鞘尖端受单侧光刺激后,生长快,因而使胚芽鞘消灭向光弯曲。琼脂片云母片结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。2.1910琼脂片云母片结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。3.1914〔Paal〕的试验结论：胚芽鞘的弯曲生长，是由于尖端产生的影响在其下局部布不均匀造成的。结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。4、1928结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。1934年从人尿分别出具有生长素效应的物质——吲哚乙酸。1942年从高等植物中分别诞生长素，并确认是IAA。和吲哚丁酸〔IB。生长素生理作用的应用顶端优势植物的向光性根的向重力性〔向地性〕茎的背重力性〔背地性〕顶端优势：植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。形成缘由：顶芽产生的生长素向下运输，大量地积存在侧芽部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制。茎的背地性和根的向地性生长植物向光性在单侧光线照耀下，植物向光性背光侧>向光侧，背光侧细胞生长快结果使茎朝向光源一侧弯曲生长素类似物的应用促进扦插的枝条生根促进果实发育〔培育无籽果实〕防止落花落果，疏花疏果〔4〕用作除草剂1、促进扦插枝条生根用肯定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。2、生长素促进果实发育〔无籽果实〕传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。如何培育无籽果实？在没有承受花粉的雌蕊柱头上涂上肯定浓度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，由于没有受精，果实内没有种子。3、防止落花落果农业生产上常用肯定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以到达保蕾保铃的效果。4、杂草的除草剂如(2，4-D)，适用于麦田、稻田，双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感，用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物〔杂草〕的生长。生长素〔auxin〕IAANAA2,4-三氯苯氧乙酸2,4,5-。促进细胞分裂与根分化2,4-D细胞分裂素〔cytokinin〕感动素〔K6-苄基腺嘌呤6-B，玉米素Z，异戊烯氨基嘌呤〔2I〕刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。细胞分裂素主要作用：促进细胞分裂细胞分裂素与生长素相互作用生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。2,4-D2,4-D1mg∕L+6-BA0.1mg∕L生长素含量低于细胞分裂素赤霉素〔gibberelinacid〕GA3促进细胞生长刺激不定胚发育成正常小植株病苗瘦长，叶色淡绿，比健苗高，病株节间伸长，茎节上逆生不定根，茎杆渐渐变褐，腐烂，其内有白色蜘