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文档简介
荧光定量PCR技术
生化教研室研究生实验一、实验目的掌握荧光定量PCR的原理熟悉荧光定量PCR的操作步骤了解荧光定量PCR的应用二、实验原理
ABIPrism®7500型荧光定量PCR仪7500功能一览：•绝对定量(AbsoluteQuantification)–自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比•相对定量(RelativeQuantification)•等位基因分型(AllelicDiscrimination)•阴阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC)实时荧光定量PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增，扩增反应结束后，可通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。实时荧光定量PCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。实时荧光定量PCR技术：
荧光阈值和CT
值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）三、实验剖内容垂：定滔量细越菌16终S变RN耳A基因引物F：TC娱CT系AC春GG恼GA阴GG畅CA牧GC棍AG震T引物R:假G训GA潜CT纽奉AC伍CA佣GG犬GT其AT嫩CT奋AA球TC酸CT渐GT帽T扩增钓片段44叮7b允pSt为ag飞e195涛℃挥30聪s袖1c白yc赌leSt口ag被e295乳℃撕5色s洲60泳℃鉴4轨5s绿40肤cy红cl柿eSt业ag怜e395刷℃坊1倘5s凝6墨0℃丝式1m春in开9得5℃纳15牛s实验法分组按实纤验台束分六津组。第一行组：赞做阴被性对障照和台样品贼，各抹做2个重渠复。第二棒组：逮标准迎曲线描一个汽浓度毁（10-1），齿做2个重牢复。第三窗组：辩标准练曲线额一个乘浓度棕（10-2），停做2个重琴复。第四肉组：郑标准蚀曲线闷一个顽浓度晃（10-3），傍做2个重唯复。第五救组：社标准态曲线写一个闷浓度疲（10-4），锹做2个重傍复。第六兔组：继标准遗曲线侄一个斤浓度尼（10-5），祸做2个重胳复。操作袍步骤注：（修见下抓发的搜资料寇页）四、五、晒实时捏荧光织定量PC遮R技术董的应狡用六、烟思考兔题1.荧光校定量PC宋R的原具理和锁应用左实例冠。2.使用SY谢BR熟G材re砍en希I作荧矿光染酱料，凑如何良提高触荧光躲定量PC接R结果糠可靠仪性？七、证实验怕报告每人腐写一婚份实
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