高中生物教学课件：血红蛋白的提取和分离人教选修

本课题学习目标

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理本课题学习重点和难点

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

4、课题难点：

①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息

蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.提问：血液有哪些成分？1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1.分离生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示

（二）缓冲溶液

1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。

能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:3.缓冲溶液的配制:通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液缓冲溶液的组成及分类①弱酸及其对应的盐：②弱碱及其对应的盐：③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:H2CO3→NaHCO3；CH3COOH→CH3COONaNH3•H2O→NH4CL;NH4OH→NH4CLNaHCO3→Na2CO3；NaH2PO4→Na2HPO4

缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下三种类型：（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白疫质在平聚丙骗烯酰贵胺凝江胶中晌的迁移未率取决于它栽所带净电纸荷的多雅少以沾及分子共的大套小等因祝素。（SD仁S的径作用卖）为了禁消除净电腰荷对芬迁移扮率的启影响稳，可以拍在凝汽胶中号加入刮SD葱S。2.适原理吹：SD基S能辈使蛋建白质们发生抵完全循变性。由跨几条洁肽链税组成办的蛋白互质复匀合体在S始DS助的作饥用下寻会解聚殿成单库条肽雾链，因疮此测兽定的练结果纸只是单条终肽链徒的分眨子量。S质DS浩能与携各种隙蛋白定质形屈成蛋白扯质—笼SD饮S复赌合物，S脚DS逐所带菊负电沃荷的遮量大津大超舰过了竿蛋白拨质分竞子原有谅的电清荷量。因捞而掩田盖了不同平种蛋白损质间相的电荷彻差别，使拨电泳浓迁移册率完娱全取瞒决于义分子董的大页小。3.术S毕DS余作用糖机理辫:用S锤DS吵测定灶蛋白稠质分庭子量译的方方法使用吗SD苦S—铅聚丙阁烯酰刻胺凝玻胶电梯泳测定凶蛋白蛋质的把分子构量时掏，可似选用衣一组已知链分子缺量的旁标准匪蛋白同时组进行驰电泳责，根栗据已蝇知分覆子量蜻的标固准蛋坟白的电泳炒区带论位置，用电泳岸迁移辩率和痰分子锯量的滩对数根作标熄准曲末线，可净以测芽定未知晶蛋白胜质的分贼子量咐。市场很上有势高分萌子量惧、次汤高分家子量膀及低篇分子谋量的此标准五蛋白缩慧试剂旧出售稠。二、泳实验诉操作样品缺处理赴→粗厌分离→纯化→纯度半鉴定1.果样品蒸处理替：（一石）蛋崖白质污提取浮和分陶离步慰骤（二捐）操遍作过丢程本课祝题可火选用驴猪、汁牛、须羊或拼其他呈脊椎兔动物杠的血雀液来迫分离嫌血红泪蛋白肃。(1粘)红烦细胞殿的洗米涤:①洗兄涤目刃的:去除朴杂蛋贪白，府以利巧于后守续血蚂红蛋袋白的分离吼纯化啄，洗雄涤次夸数不亮可过戚少。②洗剩涤操包作：1、观采集塞血样岂。2、银低速颈短时飘间离弊心（速租度越仆高和闹时间急越长早，会找使白组细胞骑和淋侮巴细导胞等偷一同厚沉淀惑，达猜不到短分离继的效译果）3、佣吸取帜血浆猜：上贡层透班明的李黄色栏血浆及。4粪、盐胳水洗魄涤：侦用五脸倍体别积的迁质量油分数壳为0蠢.9喷％的骨氯化既钠溶递液洗欲涤。门5、搜低速盘离心（低笛速短拴时间窝）6、笔重复凉4、朽5步分骤三闻次，限直至榨上清膝液中酿已没浙有黄寻色，诞表明凝洗涤献干净碑。采集遇得到谨血液柜式耕离心责机初次逆离心虫后的某结果3次郑洗涤移后的渔结果(2都)血术红蛋巨白的赤释放雀：加蒸业馏水昨到原血低液体份积，再庭加4棋0％摸体积厕的甲苯，置稍于磁力透搅拌罗器上充泥分搅弊拌1绞0分毫钟（加速抚细胞佛破裂）,变细胞促破裂受释放舒出血惧红蛋梢白。(3慰)分败离血立红蛋厅白溶先液：①过扒程：将搅絮拌好望混合押液转塘移到刷离心匠管内忘，以喷20紧00贴r/消mi献n的棕速度柔离心单10东m聚in诞。②试话管中艰溶液马层次厦：第1窃层（遍最上馅层）剧：甲觉苯层趋（无色团透明）；蒜第2赶层（场中上雅层）侍：脂佛溶性馅物质壤沉淀咬层（白色区薄层竖固体）；坐第3淋层（筑中下慰层）旁：血爪红蛋暗白的降水溶爸液层毙（红色犯透明抵液体）；沸第4庄层（裂最下但层）营：杂勾质沉撒淀层陈（暗红小色）。③分牲离：用滤切纸过长滤，披除去脱脂溶闻性沉遭淀层阔，于走分液供漏斗制中静驻置片蛛刻后储，分凳出下此层的红色白透明继液体。二、浙实验号操作磁力鸽搅拌恒器搅拌造器转裁子搅拌茶器正司在工锹作甲苯探层（无色井透明）白色涝薄层迷固体红色熊透明奋液体杂质涨沉淀固层（暗红赴色）试管愁中溶诞液层怠次(4摇)透砌析敬：①过爷程：取1阁ml农的血际红蛋尽白溶卫液装攀入透梅析袋神中，携将透群析袋缺放入替盛有么30欧0m停l的刃物质肯的量辩浓度敞为2象0m墨mo茂l/员l的磷酸论缓冲度液中（乳pH换为7色.0声），秘透析贞12团小时糕。②透预析目哀的：除去我样品箱中分绒子量凶较小绸的杂鲁质。二、惯实验晕操作透析雷过程红动画搂演示利用扎透析握袋透虚析2.祥凝胶她色谱授操作宋:（1民）凝壤胶色件谱柱按的制吓作：①取忙长4意0厘何米，爷内径勤1.嘱6厘削米的舰玻璃寻管，两端极需用院砂纸哗磨平才。②底签塞的垒制作壁：打孔俯→挖危出凹稍穴→秀安装买移液烂管头腾部→颗覆盖悉尼龙失网，支再用笋10欣0目瞎尼龙塑纱包咏好，笼插到艳玻璃躁管的满一端。注意牵事项：底塞望中插垫入的掩玻璃写管的羞上部杨不得都超出贷橡皮辟塞的竿凹穴读底面舰，否麻则难椒以铺喷实尼棒龙网期，还醒会导乱致液赢体残间留，安蛋白答质分班离不啊彻底沈。③顶纠塞的侵制作昂：打孔碧→安蹲装玻于璃管。④截组装或：将上远述三拦者按各相应扇位置钉组装漫成一厕个整鸦体。⑤安习装其糖他附渐属结职构。（2阅）凝看胶色招谱柱巡寿的装归填①凝偏胶的灶选择跃：A、醉材料祥：交联庆葡聚盆糖凝俘胶（困G-冷75所）。B、豆代表滔意义晋：“G姓”表卡示凝册胶的室交联弃程度辩，膨江胀程攻度及椅分离研范围。75具表示泼凝胶棚的得稿水值京，即留每克析凝胶搏膨胀番时吸湾水7糠.5叔克。②凝诸胶的必前处艳理：配置鬼凝胶厨悬浮聪液：计算膝并称捧取一堆定量像的凝似胶浸屈泡于译蒸馏鹅水或态洗脱俗液中渡充分牧溶胀桃后，物配成梢凝胶紧悬浮座液。③凝喂胶色读谱柱肃的装图填方专法：A、罢固定愁：将色厉谱柱芽装置鹅固定专在支贝架上季。B、塔装填便：将凝哀胶悬牢浮液窜一次刺性缓喇慢倒林入色早谱柱客内，证装填遇时轻良轻敲乡丰动色土谱柱行，使擦凝胶努填装叫均匀腰。注意者：1倍、凝嚷胶装窜填时事尽量斑紧密茂，以制降低两凝胶授颗粒鞭之间凡的空态隙。2、者装填若凝胶昌柱时建不得叔有气鹅泡存田在：因为锦气泡太会搅祝乱洗豪脱液傍中蛋召白质脏的洗穿脱次彩序，编降低蛙分离飞效果。装配浑好的鸡凝胶偿柱④洗估涤平项衡：装填粮完毕弟后，荡立即烂用缓胃冲液炕洗脱咽瓶，欲在5短0c斥m高终的操盗作压陷下，承用3厘00写ml旱的2腥0m架mo都l/识l的磷酸弓缓冲表液（挺pH的为7执.0承）充分品洗涤能平衡12孟小时。注意怎：1、污液面健不要柔低于读凝胶局表面皇，否旅则可冠能有赏气泡参混入佩，影订响液电体在费柱内感的流露动与逆最终妨生物亚大分仓子物滨质的阴分离列效果隆。2、丹不能迎发生穗洗脱骨液流景干，厅露出惕凝胶便颗粒浴的现好象。（2召）凝缠胶色涉谱柱吸的装甘填50际cm誉高（3袋）样败品加葡入与穗洗脱①调催节缓紧冲液救面：打开麻下端副出口御，使抚柱内浓缓冲滥液缓修慢下妨降到而与凝早胶面蜓平齐茎，关恒闭出胸口。②滴冤加透堵析样享品：吸管陕吸1铺ml伟样品咏加到粒色谱翼柱的拾顶端柄，滴英加样赖品时栽，吸浸管管颤口贴愉着管灰壁环协绕移侵动加宅样，拨同时阶注意粱不要此破坏品凝胶阅面。③样蜜品渗派入凝费胶床鸭：加样宁后打葵开下保端出每口，冠使样冤品渗伪入凝顺胶床侍内，腰等样重品完丘全进展入凝德胶层捉后，帐关闭巧下端兽出口立。④洗夸脱：小心皱加入pH寨=7博.0的2页0m板mo耻l/凳l的水磷酸民缓冲第液到磁适当跑高度腿，连啦接缓刃冲液酿洗脱铁瓶，临打开党下端呢出口命进行毒洗脱爆。⑤收筐集：待红邪色的翼蛋白片质接愿近色乖谱柱伍底端皂时，阻用试劲管收无集流害出液兔，每比5m慈l收块集一辽试管及，连境续收剪集。（在秀分离允过程狸中，压如果鼻红色唇区带神均匀龙一致阅的移气动，声说明编色谱晌柱制排作成搬功）⑥注告意：正确尊的加辆样操尚作：1、螺不要略触及砍并破惨坏凝旅胶面贸。2、各贴壁的加样定。3、嘴使吸燥管管仪口沿衰管壁菠环绕团移动星。（3训）样负品加嫩入与玻洗脱注意腥：正确店的加随样操贫作是坟：1、蛇不要缺触及梦并破狠坏凝简胶面姨。2、吨贴壁桂加样铲。3、厌使吸段管管失口沿泪管壁抽环绕池移动跳。开始温进行闹层析收集永得到哈的纯武化后增的蛋伍白思考好下面妻的问财题：让血荣红蛋门白处条在稳辩定的章pH还范围炕内，吓维持知结构厨和功年能。1、朱在血悼红蛋资白的济整个直过程喷中不观断用筹磷酸抛缓冲视液处柜理的遭目的脾是什土么？2、劈燕与其兵他真坡核细计胞相友比，胃红细浸胞有朱什么际特点绝？这价一特展点对炉你进贷行蛋透白质护得分乌离有淘什么夜意义文？血红愿蛋白看是有承色蛋喇白，扬因此灾在凝南胶色将谱分和离时启可以浙通过娘观察熔颜色诸来判垦断什督么时枝候应叉该收哀集洗霜脱液腐。这德使血欧红蛋狮白的身分离吸过程禁非常恋直观顾，大兴大简樱化了爱实验六操作击。3、棕你能扬描述断血红屯蛋白爹分离吴的完鸟整过隶程吗打？血红众蛋白豆提取患和分固离的雁程序紫可分撕为四喘大步耽，包艇括：样品骑处理遍、粗厨分离额、纯互化和卵纯度逃鉴定。首联先通滴过洗柱涤红品细胞坛、血违红蛋吹白的括释放义、离让心等搜操作器收集肠到血红荒蛋白沃溶液，即棒:样普品的香处理丸；再孕经过允透析板去除视分子轧量较是小的形杂质嚷，即庆样品咏的粗浩分离阀；然落后通过势凝胶仔色谱敌法将相嫂对分楚子质坐量较暑大的杂质暮蛋白梁除去，即恰:样搁品的菌纯化顽；最过后经聚丙椒烯酰钥胺凝夺胶电拼泳进行岔纯度众鉴定苗。（三铅）S线DS著—聚钱丙烯催酰胺局凝胶恋电泳倾（选威做）2.捧试剂是的配皱制：鉴定雾血红教蛋白孟纯度此。1.旺目的星：3.方法万步骤随：（竹略）观察番你处论理的叮血液激样品踩离心嫩后是否陵分层（见滑教科派书图辛5-欠18回），如果脸分层碑不明逮显，蜜可能陡是洗躺涤次喉数少始、未崭能除脾去血减浆蛋尸白的季原因己。此外界，离插心速瞎度过忌高和离时间维过长工，会止使白写细胞捕和淋却巴细衬胞一缝同沉回淀，勺也得蜻不到趴纯净耻的红生细胞锐，影胸响后搜续血打红蛋陕白的轮提取者纯度枯。三、勾实验惧结果谋分析略与评胆价1、观你是种否完诞成了兴对血恒液样敲品的药处理序？你锁能描春述处达理后希的样奔品发厘生了间哪些巡寿变化基吗？2、低你装舍填的兴凝胶爹色谱渔柱是平否有炒气泡奥产生蛮？你楼的色幸谱柱行装填福得成醒功吗蔬？你旗是如喂何判氧断的摊？由于榴凝胶祸是一再种半乓透明剩的介翻质，傲因此浊可以游在凝巾胶柱沙旁放她一支许与凝太胶柱讯垂直迷的日揉光灯犁，检想查凝睬胶是营否装瓦填得杯均匀伸。此比外，灾还可待以加蛙入大亡分子你的有脾色物雕质，例如益蓝色卫葡聚蛛糖—妥20堤00拿或红丝式色葡灾聚糖集，观察絮色带僚移动罢的情苏况。引如果似色带枝均匀符、狭巧窄、穗平整悼，说策明凝举胶色丙谱柱伯的性须能良逢好。如果机色谱罚柱出迹现纹守路或述是气意泡，美轻轻模敲打坦柱体手以消好除气顿泡，碎消除挑不了持时要寸重新篮装柱康。如果谦凝胶巧色谱回柱装水填得炎很成铁功、粥分离赤操作抹也正密确的好话，纠能清蓝楚地咏看到青血红凝蛋白拍的红稠色区良带均置匀、答狭窄盲、平登整，尼随着晌洗脱崭液缓萌慢流蓬出；如果瞧红色仰区带状歪曲熟、散尺乱、蛙变宽裳，说慰明分鲁离的诸效果歼不好朵，这抢与凝睛胶色另谱柱给的装柿填有挡关。3、押你能牵观察缘瑞到蛋侵白质筹的分敢离过紧程中泰红色差区带祸的移挡动吗谋？请另描述祥红色柴区带远的移捏动情区况，险并据鱼此判唇断分吗离效队果？（三肌）S沾DS于—聚藏丙烯愁酰胺盘凝胶趁电泳2.角试剂雀的配叛制：鉴定杂血红紫蛋白叠纯度查。1.施目的悼：①丙跑烯酰里胺和帽N,匀N’共-亚河甲基叮双丙坟烯酰姥胺:用去影离子仓水配介制2众9%磁（2缴9匹g/寻10闸0炸mL殃，下婶同）悟的丙业烯酰砖胺和剂1%奋的N兼,N示’-链亚甲吴基双昼丙烯甚酰胺驱的贮赶存液户。②十章二烷晒基硫概酸钠春（S达DS唉）:用去忘离子苏水配诱成1子0%哨的贮焦存液俭，于陪室温努保存救。③用疫于制凝备分最离胶阅和浓权缩胶热的T朋ri跪s缓著冲液衔。④愚TE蓝ME档D夺：作用放通过只催化愧过硫堂酸铵巨形成亦自由托基而补加速盼丙烯布酰胺低与双酷丙烯晋酰胺街的聚抚合。⑤用文去离漏子水宰配制猎10涉%棍过硫吩酸铵攀：作用蹈是提烤供驱暖动丙争烯酰宁胺和将双质丙烯厨酰胺泥聚合驶所必碑需的怎自由高基。伏此溶榜液须返配制纵新鲜群液。⑥T麦ri漏s—乐甘氨妄酸电第泳缓党冲液恩：25剥m可mo刮l/毫L辣Tr灰is瘦，2救50乎m舰mo界l/窑L典甘氨挖酸召(p槽H黑8.赶3)晓，0膊.1旱%的时SD秧S。⑦样怖品处重理液柴：50絮m肚mo责l/棒L鸽Tr轧is粥—H纸Cl边(p监H泥6.姨8)吸，1画00馅m扁mo煎l/归L嚷DT潮T(振巯基崭苏糖朋醇)塑或用妈5%驻的巯何基乙创醇，欧2%傻的S星DS灾，0毛.1搏%的勾溴酚旱蓝，窑10粘%的阶甘油爆。⑧染傍色液刷：0.次1%桨的考价马斯践亮蓝笨R2稠50弦，4伟0%净的甲麦醇，执10廉%的握冰醋碎酸。⑨脱器色液释：10争%的希甲醇纷和1蜜0%介的冰怒醋酸倾。1、易由于皱制备绘凝胶待的丙狠烯酰峡胺和骂双丙术烯酰熔胺具块有很垫强的作神经毕毒性漠，并坟且容叠易被加皮肤病吸收任，因爬此操傻作必殊须在润通风虾橱内建或通焦风处鲜进行是。2、岛TE与ME轿D和杯过硫铺酸胺位对黏木膜和兰上呼岗吸道狱组织含、眼越睛、赚皮肤茅等有冈很大求的破敌坏作驱用，释吞服国可致保命。3、斥在进论行电条泳操师作时妨一定关按照任实验盘要求与和步传骤完申成。果操作参时要熊戴好压一次奋性手怠套。注意寸事项匀：（三前）S氏DS妙—聚末丙烯遮酰胺宣凝胶手电泳①它SD汇S-声聚丙册烯酰较胺分践离胶隐制备该：用去朋离子率水4词.6膛m辨L，奶30坐%的概丙烯愚酰胺欺2.寺7驴mL贼，1裹.5脱mo追l、赚pH帝8欺.8累的T替ri瓜s缓注冲液宗2.才5躁mL山，1具0%贫的S团DS杰0志.1砍m奏L，袋10败%的舞过硫西酸胺笔0.控1香mL姻，T芳EM团ED依0域.0办06才mL垂，混斯合均头匀，冤迅速缩慧灌注革在两痕玻璃评板的苹间隙锡中间僵，要懒留出宁灌注截浓缩哗胶所象需空垮间(数梳子絮的齿杂长再抄加0购.5换c晴m)群，再代在胶抢液面扰上小楼心注皂入一仁层水顶（约熄高2与—3蹈m铃m）币，以课阻止状氧气尸进入袭凝胶孟溶液少。②分倍离胶雀聚合看完全留后（抓约3青0着mi文n）房诚，倾丙出覆宅盖水雄层，鲜再用栋滤纸愿吸净供残留破水。③配拿制S斜DS滔—聚革丙烯协酰胺禁凝胶律电泳想浓缩缝胶溶泊液用馅去离乐子水降2.角7如mL梢，3费0%从的丙突烯酰独胺0么.6亿7刻mL映，1透.0渐m莲ol枣、p隶H蚕6.矿8的野Tr克is膀缓冲叨液0门.5踢m倦L，逆10叫%的倾SD枣S0剂.0豪41强m野L，漠10杰%的吼过硫策酸胺或0.洗04巩m魂L，流TE倾ME拌D姓0.渣00肤4闷mL伙，混挺合均码匀，巧直接五灌注感在聚竿合的池分离污胶上旋，并鼻立即迹在浓柏缩胶腹溶液恳中插秤入干殃净的爱梳子嫁。整个甚操作你过程攀应注塘意避包免气聪泡的公产生妙。然灵后再砌补加施浓缩右胶溶僚液，体使其谁充满品梳子应之间插的空新隙，为将凝略胶垂倘直放霜置于限室温第下聚利合。（1配）根凉据厂惭家说纹明书秤安装刘电泳絮用的围玻璃市板（2恐）S米DS灾—聚杀丙烯概酰胺害凝胶姿制备淡：3、辅电泳强方法铸步骤（3耗）样额品处焰理：在电窜泳样球品中堪按1剧∶1艺体积茅比加搏入样会品处自理液税，在犁10笛0惨℃温副度下锐加热练3轮mi死n，碗以使臂蛋白扒质变鸡性。（4腰）浓缩授胶聚局合完躲全后妙（3盐0宗mi钢n）践，小架心移残出梳挤子。叉把凝斩胶固要定于舍电泳谷装置躲上，贞上下牛槽各浪加入书Tr她is借—甘炸氨酸疼电泳版缓冲听液。厦必须依设法赔排出绝凝胶侵底部杀两玻筋璃板诸之间惜的气论泡。（5壶）加茂样：按顺奔序加充样，扑加样羡量通亩常为嘱10版—2却5专μL卸。样品品可榆以多抚加几狡个，辣例如罪，血粉浆样笋品红耗细胞杨破碎庄后(搞即进阁行凝草胶色离谱分丘离之碰前)兼的样录品和堤凝胶勉色谱催分离各之后较的样守品（6谁）电近泳：将电续泳装键置与挂电源准相接饼，凝辆胶上踢所加撤电压计为8咱V豪/c卷m。晨当染画料前科沿进仰入分行离胶寄后，贷把电位压提电高到钱15球V撇/c练m，治继续志电泳钻直至遭溴酚沾蓝到临达分币离胶宽底部葱上方适约1匆c迁m处订，关主闭电倍源。（7侵）剥看胶：从电尘泳装弓置上构卸下梳玻璃茫板，犁用刮德刀撬片开玻旧璃板延。将首紧靠胜最左环边一预孔（滩第一芦槽）痰凝胶辫下部抗切去哈一角浮，以闯标注君凝胶瓶的方蓄位。（8墨）染第色：将电海泳凝屿胶片呀放在涌考马谱斯亮井蓝染骗色液苹中染芹色1脂-2衔h吵。（9御）脱况色：染色雷完毕豪，倾随出染辽色液桑,换敬脱色部液脱印色3嚼-1驴0滚h，乱其间倘需多盘次更朱换脱贵色液竿至背勾景清次楚。（1搏0）植观察映结果买：SD旦S电套泳的狭成功删关键始之一监是电局泳过黄程中团，待舒别是跃样品馋制备下过程休中蛋屠白质济与S芝DS辫的结印合程芝度。3、舰电泳允方法室步骤观察坚你处胶理的叨血液昨样品芬离心垮后是否个分层（见真教科有书图耻5-奏18窃），如果年分层嫂不明与显，棉可能逼是洗乡丰涤次园数少乳、未锻能除矮去血天浆蛋男白的身原因莫。此外梦，离母心速桶度过眼高和斗时间臣过长氏，会述使白情细胞涉和淋昼巴细音胞一识同沉陕淀，杰也得蚂不到评纯净脱的红暖细胞帝，影萄响后坟续血宏红蛋灭白的呆提取见纯度为。三、分实验惭结果通分析哈与评采价1、望你是挨否完角成了瓜对血准液样具品的它处理抬？你勉能描段述处厦理后尿的样柱品发昼生了随哪些厉变化荡吗？2、尺你装到填的哲凝胶徐色谱层柱是呀否有独气泡究产生求？你掏的色烫谱柱梢装填触得成谁功吗趋？你选是如腿何判恭断的粉？由于振凝胶器是一仿种半恩透明捕的介鞋质，与因此纱可以掏在凝备胶柱既旁放啊一支连与凝尖胶柱倘垂直滋的日痛光灯筋，检积查凝耐胶是搂否装汇填得驻均匀摩。此邪外，梨还可梦以加修入大碌分子赶的有值色物俱质，例如怒蓝色尘葡聚垂糖—浊20泊00挺或红僵色葡环聚糖特，观察耀色带线移动鞋的情饼况。供如果陪色带仓均匀按、狭男窄、骡平整夜，说慈明凝点胶色疏谱柱催的性拆能良牧好。如果疾色谱绞柱出早现纹柄路或束是气竟泡，同轻轻裂敲打胞柱体纳以消振除气来泡，竖消除昌不了逗时要新重新更装柱谎。如果照凝胶单色谱斜柱装瓜填得庸很成紫功、蜓分离亏操作闲也正箭确的牙话，阁能清眯楚地践看到胡血红富蛋白抛的红经色区算带均表匀、挺狭窄麻、平蛙整，宾随着戏洗脱歉液缓担慢流狗出；如果泥红色盏区带概歪曲置、散基乱、叼变宽盼，说医明分愧离的文效果寨不好距，这性与凝预胶色引谱柱票的装侦填有城关。3、唤你能喷观察味到蛋西白质指的分严离过躬程中毒，红航色区堂带的钱移动轿吗？通请描永述红怠色区桑带的限移动答情况猴，并拦据此架判断落分离侧效果革？三、福实验愈结果慕分析炒与评笼价本课品题作手业;1.态凝胶截色谱吊法分木离蛋予白质受的的服原理努是怎姨样的乐?2.康什么卵是缓建冲溶院液?晓它的虑作用纳是什蚂么?3.氏电泳工的作逆用及去其原年理是交什么秆?4.拾你能顶描述公血红载蛋白执分离铁的完贪整过申程吗黎?5.起与其椒他真玻核细匹胞相桥比,劫红细桥胞有兄什么淘特点穴?这缺一特困点对蹲你进付行蛋白毕质的具分离坡有什夕么意桶义?凝胶吵色谱伤法也犯称为森分配杠色谱岛法，颈它是根据摩分子喉量的驱大小汪分离像蛋白珠质的方仍法之赶一。匆所用商的凝精胶实西际上缴是一续些微蜡小的丝式多孔牵球体舞，这颗些小沟球体迈大多凭数是刻由多市糖类层化合演物构歇成，远小球抛体内默部有范许多检贯穿横的通龄道，点当一域个含纳有各耗种分京子的薪样品尿溶液散缓慢帆流经姨时，巨各分屑子在抱色谱阁柱内膝进行挪两种确不同已的运尖动，诉即垂束直向朋下的升运动跃和无治规则讯的扩看散运湿动。虏相对扣分子河质量呈较大衣的蛋加白质证分子助不能锋进入滔凝胶洞颗粒横内部穗，只岩能分芽布在谣颗粒丙之间途，通债过的肾路程助较短喜，移汤动速规度较姨快；浮相对脊分子田质量部较小鸭的蛋网白质沙分子哈比较耍容易降进入友凝胶吗内的硬通道秋，通扰过的苏路程衔较长疾，移鼠动速哪度较许慢。纱因此睡，样品谦中相禁对分摇子质壮量较钩大的衬蛋白墙质先预流出淘，相哑对分容子质掩量中债等的键分子林后流阵出，疼相对谊分子渔质量赏最小登的分梦子最唐后流慨出，这幅种现汪象又刚叫分子扔筛现缓象。此枯外，依凝胶欲本身从具有消三维堂网状妖结构戏，相俊对分激子质旁量大融的分拥子通握过这坚种网师状结粪构上睛的空申隙时涌阻力奴大，庭而相锯对分碌子质届量小磁的分泛子通柱过时避阻力旱小，乔因此继不同枕分子疲量的框蛋白始质分结子可讨以获振得分环离。1.游凝胶数色谱臭法分梦离蛋山白质鸽的的益原理候是怎刊样的锤?练习乎2.什什么妙是缓属冲溶迫液?说它的暗作用嗓是什县么?在一沿定范驾围内旨，能影对抗揉外来闪少量犬强酸这、强萝碱或渴稍加泽稀释摔不引掏起溶码液p搂H发培生明析显变唯化的哥作用半叫做缓冲披作用，具蜂有缓得冲作芝用的厅溶液桨叫做缓冲委溶液。缓简冲溶沸液通纤常是幻玉由一浓或两托种化恋合物盘（缓达冲剂叉）溶锯解于孩水中精制得祖，调宅节缓输冲剂森的配宴比就史可制嗓得不祥同p外H范肾围的贩缓冲技液。缓冲长溶液赴的作央用是维持氏反应扰体系流的p梦H不启变。在圾生物速体内隶进行貌的各乏种生涌物化避学过偷程都颜是在趣精确俊的p贱H下近进行盖的，诉受到载氢离雅子浓备度的略严格前调控岩。为行了在摩实验型室条蓬件下娱准确闻地模泄拟生造物体如内的献天然甜环境浪，就暖必须飘保持分体外雕生物精化学容反应筛过程打有与牲体内掘过程梁完全雄相同暑的p缓H。练习毁3.电电泳那的作柳用及堪其原体理是租什么品?电泳脾是指桌带电霞粒子项在电坝场的器作用拜下发勇生迁娇移的畜过程鸟。许败多重做要的命生物蒜大分踏子，抢如氨沟基酸继、多董肽、哀蛋白无质、润核苷概酸、添核酸龟等都亦具有技可解陈离基我团，谷它们轧在某厚个特折定的刊pH炭下会进带上马正电孩或负间电；扩在电颗场的