分子生物学第三章下转录后加工

分子生物学第三章下转录后加工第一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第一节tRNA和rRNA的加工一.原核的tRNA和rRNA的加工参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物(1)它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。第二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五表13-1E.coli中含有的小分子核酸酶 酶 基因 底物 功能 RNaseP rnpA tRNA5′端 内切 RnaseO rnpB

RnaseBN ? tRNA3′端 外切 RnaseD rnd tRNA3′端 外切 RnaseT ? tRNA3′CCA 外切 RnaseⅢrnc rRNA和mRNA 内切 RnaseR ? rRNA和mRNA 外切 RnaseE rne 5SrRNA 内切 RnaseⅠrna 大部分RNA 内切 RnaseⅡ rnb RNA 外切 多核苷酸磷酸化酶pnp RNA外切 RnaseHrnh RNA-DNA杂合链内切

《GENES》IV，1990.B.Lewin,Table14.2第三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(一)tRNA的加工tRNA的加工分成3个阶段(1)“斩头”，形成5′末端；(2)去尾，形成3′-OH末端。缺-CCA的

tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。(3)修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA) 第四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五MaturetRNA第五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五真核tRNA内含子的特点：①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；③外显子和内含子交界处无保守序列；④内含子的剪切是依靠RNase异体催化；⑤内含子和反密码子配对形成茎环。

第八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

二真核的tRNA和rRNA的加工真核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5′端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)tRNA的前体分子中含有内含子。第十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五真核tRNA内含子切除的特点：(1)没有交界序列，也没有内部引导序列；(2)剪切反应的信号是二级结构，而不是一级结构；(3)是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核糖拟酶或snRNP；(4)反应的本质不是转酯反应。第十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五酵母tRNA前体内含子3’和5’端的剪切是由内切酶的不同亚基催化的。亚基Sen34,Sen2剪切3’端和5’端.Sen54可能通过量度成熟结构域的距离来决定5’端剪切位点的位置。A1碱基对也是重要的。第十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五古细菌tRNA用于剪切的核酸内切酶在每个“突起－螺旋－突起”片段的突起处切割每条链第十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

真核tRNA的加工和原核的区别(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接内含子的过程；(3)都要加CCA。第十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五真核细胞中rRNA的加工途径(1)切除5′端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。

Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。第十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第二节前体mRNA的加工mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。真核mRNA的加工一般要经过四步：

(1)5′加帽；

(2)3′加尾；

(3)切除内含子；

(4)修饰：对某些碱基进行甲基化。第十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

原核生物mRNA的加工原核生物的mRNA很少经过加工，但在少数情况下多顺反mRNA先被内切核酸酶切成较小的单位再成为翻译的模板第二十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第二十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第二十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第二十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五二真核mRNA前体的加工(一)核内不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；

(3)两者5′端都有帽子结构；

(4)表明二者为相同的聚合酶所合成；

(5)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。第二十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五hnRNA的结构的特点(1)5′端有帽结构；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；(4)有重复序列，位于寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。第二十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第二十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒（hnRNP）,颗粒中蛋白质包围着hnRNA。体外研究表明hnRNA的形状是一个球体和一个与之相连的纤维状结构。第二十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五在细胞核中，RNA加工包括3‘端和5’端修饰以及内含子的去除等。剪切需要在内含子与外显子交界处产生断裂，然后将外显子末端连接。成熟的mRNA通过核孔被运到细胞质中，在那里它完成翻译。第二十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五1．加帽(1)剪接前加帽如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒和口炎病毒第二十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五7－甲基鸟苷三磷酸第三十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第三十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五帽子的类型在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称0型帽子（cap0）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-o位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap1)；此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-o）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructure）。第三十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第三十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五帽子结构的功能(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5′不被酶降解；(3)翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别。第三十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(2)加尾(1)CPSF特殊组分cleavageandpolyadenylationspecificityfactor剪切和多聚腺苷酸化特异因子识别AAUAAA并指导其它的活性(2)CF(剪切因子)在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；(3)PAP末端腺苷转移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP（poly(A)结合蛋白与poly(A)结合，反应停止。第三十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第三十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五加Poly(A)的反应第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。第三十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五加工的要素是：

(1)热敏因子，功能不祥；

(2)剪切位点的发夹结构（和序列无关，与二级结构有关）；(3)U7snRNA,长56nt,其5’端有一保守序列和H3mRNA剪切点下游的GAAAGA互补。有些mRNA的3’端无poly(A)尾，如在爪蟾卵母细胞中组蛋白H3的mRNA.成熟时要切除一段3’端序列。第三十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第三节内含子的剪接一.核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫rRNA时发现的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”；是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。第三十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五核酶和传统酶的区别：(1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应。第四十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五核酶发现的意义（1）突破了酶的概念.是一种自体催化；（2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。（3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。第四十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五遗传信息的进化路线可能是：RNA→（DNA→表达）→(DNADNA)→(DNA→表达)↑↓↓↗↓RNARNA表达

||RNA病毒反转录病毒EB,HBVDNA病毒第四十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五酶组成的进化路线可能是：纯RNA→RNA为主→RNA和→蛋白为主→纯蛋白蛋白为辅蛋白并重RNA为辅

核酶RNAaseP？端粒酶一般酶类第四十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五生物体组成的进化：

蛋白（朊病毒）RNA→RNA+蛋白→RNA·DNA+蛋白DNA+蛋白→

类病毒RNA病毒巨细胞病毒(HCMV)DNA病毒第四十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五内含子剪切相关的酶第四十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第四十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

内含子的发现1977[美]Sharp&Roberts

同时发现了断裂基因(splitgene)[法]Chambon失机

鸡的输卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和伴清蛋白，而其红细胞（鸟类的红细胞上有核的）只合成血红蛋白，那么两种组织之间DNA有什么不同呢？

southern杂交

Berget，Sharp小组和Roberts小组用R环法第四十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第四十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第四十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第五十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五DNA和mRNA之间形成特殊的RNA-DNA异源双链分子结构断裂基因SplitGenes第五十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第五十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五二.内含子的结构特点

(一)内含子和外显子的分布

(二)内含子的相对性第五十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五经过删除和连接，除去无关的DNA间序（即内含子），便形成了成熟的mRNA分子断裂基因SplitGenes有的内含子可编码内切酶。第五十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五三.内含子的生物学意义有的内含子可编码内切酶。成熟酶(maturase)

归巢(Homing)调控提高进化速率

第五十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第五十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第五十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五Homing归巢在某些内含子中含有开放续框，可产生具有三种功能的蛋白。这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动，使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢。第五十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第五十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五Crick（1978年）提出了一系列问题（1）剪切若是通过酶，那么这种酶是怎样识别RNA上特定的位点？（2）剪切酶有没有特异性？（3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？切下的RNA的命运将如何？（4）内含子有无调控作用？（二）边界序列第六十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五Chambon等发现内含子切割位点有2个特点（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。这就排除了存在二级结构的可能。（2）连接点具有很短的保守序列，称为边界

顺序。其规律称为GT-AG法则（GT-AGrule)或Chambon法则。左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。第六十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

交界顺序第六十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第六十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五三．I类内含子的剪接Cech等1981年用四膜虫分离得到了35S的前体rRNA，它含有一个长413bp的内含子。此35SrRNA要加入一价或二价阳离子及GTP就可以在体外释放出413b的线性的内含子，若继续保温，那么线形内含子又可形成环状的RNA。这就意味着35SRNA在GTP的作用下可以自我剪接。第六十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五In1983,Cech&Altman,establishedtheexistenceofcatalyticRNAsThomasR.CechUniversityofColoradoUSA,1947-SidneyAltmanYaleUniversity,USA1939-TheNobelPrizeinChemistry1989"fortheirdiscoveryofcatalyticpropertiesofRNA"第六十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第六十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第六十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五重组DNA转化E.coli第六十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第六十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(一)I类内含子的结构特点是

1.其边界序列为5′U-G3′；

2.具有中部核心结构（Centralcorestrucature）

3.内部引导顺序（internalguideseguenceIGS）第七十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(二)I类内含子的剪切机制转酯反应(transesterification)

酯键从一个位置转移到另一个位置。第七十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

四.Ⅱ类内含子的剪接(一)结构特点(1)边界序列为5′↓GUGCG……YnAG↓；(2)有6个茎环结构；有分支点顺序（branch-pointseguence）第七十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(二)剪接机制无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。分枝点A的2′-OH对5′端交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻，产生了套索（lariat）结构（图13-31）；切下的外显子1其3′-OH继续对内含子3′端的交界序列进行亲核进攻，同时释放出套索状的内含子。第七十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第七十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五五.核mRNA的剪接

(一)结构特点：1.边界顺序:符合GU-AG法则。2.分枝点顺序：为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2′-OH。

3.内含子5′端有一保守序列可以和U1snRNA的5′端的保守顺序互补第八十一页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五(二)剪接机制剪接因子snRNPsU1,U2,U5和U4/U6。第八十二页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十三页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十四页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十五页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十六页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第八十七页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五剪接与mRNA出核相关联在完成合成和加工后，mRNA以核蛋白复合体的形式从细胞核内转运到细胞质中。问题是这些蛋白如何识别mRNA?如何确保仅加过工的mRNA被转运？部分答案是：剪接体可能形成于转录完成之前以去除内含子，但剪接和出核前应具有直接连系。•一个9个蛋白质组成的复合体通过剪接体同RNA结合，称为外显子连接复合体（exonjunctioncomplex,EJC）第八十八页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五EJC包含一组称为REF家族的蛋白质（了解得最清楚的成员是Aly）。REF蛋白依次和转运蛋白（称为TAP或Mex）相互作用，后者直接负责同核孔的相互作用。第八十九页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五第九十页，共一百零六页，编辑于2023年，星期五

六．反式剪接反应顺式剪接（cis-sp