基因工程菌大规模培养

17章基因工程菌的培育工程菌的稳定性一、工程菌不稳定的表现DNA二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策工程菌不稳定的因素：把握基因的过量表达，菌体的比生长速率，培育温度，培育基的组成1、培育基的组成基因的表达。2、培育温度3、菌体的比生长速率工程菌小，大量生殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。4、把握基因的过量表达外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以承受两阶段培育法，即在发酵前期把握外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。把握外源基因过量表达的方法：在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏〔诱导〕使质粒高效表达；高密度培育为了大量获得基因工程产品，通常承受高密度培育技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培育技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可削减培育体积、强化下游分别提取，还可缩短生产周期、削减设备投资，最终降低生产本钱。一、重组大肠杆菌的高密度培育重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即依据工程菌的生长特点及产物的表达方式实行合理的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反响流加。1、恒速流加作为流加补料速率。特点：相对于发酵罐中的菌体来说，养分物的浓度渐渐降低;比生长速率也渐渐降低;2、变速流加特点：质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。3、指数流加特点：流加速度指数增加，菌体密度也指数增加；它能够使发酵罐中基质的浓度把握在较低的水平，这样就可以大大削减乙酸的积存；4、反响流加、CERpHApH大肠杆菌代谢葡萄糖产生乙酸将导致pH的降低，因此pH降低速率与葡萄糖消耗速率成正比。当pH降低过否则相反。B的酵解过程和代谢物的完全氧化有很大关系。具体表现为：缺氧即溶氧值低将迫使糖代谢进入酵解途径，产生乙酸，对工程菌培育不利；溶氧水平，降低乙酸的积存。具体把握策略：当溶氧过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；二、重组酵母菌的高密度培育酵母是外源基因另一个常用的表达系统。其与大肠杆菌表达系统相比具有一些明显的优势，主要表达在：酵母可到达更高密度培育，100g/L(干细胞),400g/L(湿细胞)，500OD600酵母一般很少分泌杂蛋白，这样便有利于外源蛋白的提取和纯化；重组产物的表达水平高，毕赤酵母的表达水平比酿酒酵母高10~100倍；酵母作为一种模式真核生物，象很多真核生物一样，它分泌的蛋白质一般都要经过一次或屡次对其功免受蛋白酶的降解作用，这在重组蛋白药物中是格外重要的；蛋白常存在于包涵体中，则便能简化外源蛋白的分别和纯化工序。常见的酵母表达系统有酿酒酵母和毕赤酵母，下面主要介绍重组毕赤酵母的高密度培育1Pichiapastoris为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。甲醇利用途径的第一个2表达菌株：最常用的宿主菌为GS115(his4his表达载体：对于非分泌蛋白承受胞内表达载体，对分泌蛋白则选择分泌型载体选择强启动子：最常用的启动子为AOX1得较高产量，但是也有一些例子说明提高拷贝数可大大增加表达水平。转化方法的选择3具体方法主要是下面的所谓“三段法”其次阶段，在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培育，以进一步提高菌体量；第三阶段，即诱导阶段，开头较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。近年来，又消灭了所谓混合补料工艺，即在诱导阶段，以确定比例和速度流加甲醇和甘油混合料液。该工艺的主要优点是：1)2)3)流加，又将抑制甲醇利用途径，导致外源蛋白的表达水平降低。加量，它们都将抑制细胞的生长，后者还将影响表达水平。把握甲醇的流加量措施：DODO把握发酵液中甲醇的浓度。影响工程均不稳定的因素有哪些何谓