荧光显微镜检测原理及方法

荧光显微镜检测原理及方法一、荧光显微镜肯定波长的光激发标本放射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观看标本的荧光图像〔3-15〕。3-15荧光显微镜的构造和主要部件〔一〕光源200W50～70子的结果。它放射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍承受。超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必需有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。〔15000V〕，启50～60V4A200W2h200h20min50%。因此，使用时尽量削减启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是渐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线猛烈，因此灯泡必需置灯室中方可点燃，以免损害眼睛和发生爆炸时造成操作。的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。比较低。〔自带直流电源〕，易于携带，使用便利，已推广应用。〔二〕滤色系统滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板〔Schott〕BG12，BGBG12QB24，Q〔蓝色〕B不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530530nm530nmCorningNO：5-58，即相当于BG12。3-1。3-1荧光显微镜常用滤板型号和透光特点激发滤板 依据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，供给肯定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。300～450nmZB-2ZB-3，外加BG-38。350～490nmQB24〔BG12〕。500nm〔如罗达明色素〕可用蓝绿滤板〔如B-7〕激发。近年开头承受金属膜干预滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德LeitzFITC专用KP490S546的荧光和最好的背景为准。3UG-1UG-5GG-3K430GG-6K460。510nm〔绿到红〕，能与BG-12OG-4K510OG-1K530。460nm〔蓝到红〕，可与BG-3OG-11K470AK490，K510。〔三〕反光镜90%以上，而银的反射70%；一般使用平面反光镜。〔四〕聚光镜光器两种。还有相差荧光聚光器。明视野聚光器 光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用便利，特别适于低、中倍放大的标本观看。暗视野聚光器〔不透过紫外〕而仍旧产生黑暗的背景。从而增加了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观看舒适，可能觉察亮视野难以区分的微小荧光颗粒。相差荧光聚光器像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观看很少需要这种聚光器。〔五〕物镜〔波长范围〕适合于荧光。由光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大〔4×,5×，6.3×等〕。〔六〕目镜6.3×。过去多用单筒目镜，由于其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前争论型荧光显微镜多用双筒目镜，观看很便利。〔七〕落射光装置型的落射光装置是从光源来的光射到干预分光滤镜后，波长短的局部〔紫外和紫蓝〕由于滤镜上镀膜的物镜直接起聚光器的作用。同时，滤长长的局部〔绿、黄、红等〕，对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射，滤镜起了激发滤板作用，由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观看，荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透亮及半透亮标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培育标本等的直接观看。近年研制的型荧光显微镜多承受落射光装置，称之为落射荧光显微镜。二、荧光显微镜标本制作要求〔一〕载玻片0.8～1.2mm有时需用石英玻璃载玻片。〔二〕盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光滑。为了加强激发光〔如氟化镁〕的盖玻片，它可以使荧光顺当通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。〔三〕标本发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响推断。〔四〕封裱剂pH8.5～9.50.5mol/LpH9.0～9.5〔五〕镜油油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。三、使用荧光显微镜的留意事项严格依据荧光显微镜出厂说明书要求进展操作，不要随便转变程序。，眼睛完全适应暗室，再开头观看标本。防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。1～2h90min，超高压汞灯发光强度渐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线3～5min2～3h。荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避开数次点燃光源。4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。光。“++”—可见有光明的荧光。“+++”—可见刺眼的荧光。四、荧光图像的记录方法等仪器。但这些仪器记录的结果，也必需结合主观的推断。ASA20024。以上。因紫外光对荧光猝30s50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般争论型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。荧光显微镜的应用与留意〔体视〕使用：一、将材料片放在显微镜的载物台上。15min3min内不得再启动。三、将激发滤光片转至v，分色片调到v495475nm阻挡滤光片。uvFL40、uvFL100荧光接物镜镜检。40x100x调焦镜检．呈现荧光。六、因荧光物质受紫外光照耀时随时间的增长荧光渐渐变弱，因此镜检时应常常变换视野。uvFL10uvFL20低倍镜镜检材料(用低倍镜时不加无荧光油)。荧光图像的记录方法：荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在推断结果时，必需将二者结合起来综合推断。结果记录依据主观指标，即凭工作者目力观看。作为一般定性观看，根本上牢靠的。随着技术科学的进展，在不同程度上承受客观指标记录推断结果，如用细胞分光光度计，图像等仪器。但这些仪器记录的结果，也必需结合主观的推断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像格外必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与一般显微摄影技术根本一样。只是需要承受高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照耀30s，荧光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般争论型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。留意事项：〔1〕严格依据荧光显微镜出厂说明书要求进展操作，不要随便转变程序。〔2〕应在暗室中进展检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开头观看标本。〔3〕防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度渐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照耀3～5min2～3h。荧光显微镜光源寿命有限，标本应集