肺泡巨噬细胞的制备及RNA提取

PAM（肺泡巨噬细胞）的制备一、 准备工作1、 高压灭菌好的1XPBS两瓶（1000ml/瓶）、小托盘1个、500ml烧杯2个、大剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。2、 细胞培养液的配备生长液：10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素二、 制备细胞1、 将小猪腋下放血致死2、 从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏3、 用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备好的大烧杯中4、 转移到细胞培养室，用PBS冲洗干净肺脏表面，弃除杂物5、 在操作工作台上用灭菌好的剪刀剪断结扎了的气管。（以下步骤需无菌操作）6、 吸取PBS灌进肺内，充盈后，用于轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。7、 重复灌洗2次8、 将所收集的液体分装到50ml离心管中，4°C2000g、10min离心9、 视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次10、 在细胞沉淀中，加入2mlTrizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。11、 后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在冰箱中保存。RNA抽提第二阶段：分离阶段加入0.2ml氯仿，剧烈混匀20s，室温放置10min。10000rpm/min,4°。离心15min。第三阶段：RNA的沉淀吸取上清于5ml离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷）颠倒混匀5次，室温放置10min。（注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造朦NA的污染）10000rpm/min,4°。离心10min°（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁）第四阶段：RNA的漂洗去上清,沉淀用1ml75%乙醇漂洗，振荡，7000rpm/min,4°。离心10min,倒净乙醇。RNA沉淀加入0.5ml无水乙醇漂洗，振荡，7000rpm/min,4°。离心5min，倒净无水乙醇。（缩短RNA沉淀晾干的时间，避免RNA在空气中暴露时间过长而增加外源ftRnase对RNA的降解）第五阶段：RNA的再溶解在超净工作台上平放离心管，待离心管管壁无明显液滴时加入50nlDEPC处理的灭菌双蒸水，在55-600C温育10min，溶解RNA沉淀。将溶解充分的RNA溶液转移到1.5m】离心管中，做好标签，放入-800C的冰箱中保存备用。总RNA检测及浓度测定总RNA的完整性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，过程如下：制备1.2%琼脂糖凝胶：将1.2g琼脂糖溶于1XTAE中，稍加冷却，加入少许EB，混合均匀后，灌制凝胶，待凝胶凝固好后，即可使用。点样：取2四L总RNA与2四LGelLoadingBuffer及6四LDEPC水混合后点于点样孔中，15V/cm，电泳20min。拍照：电泳结束后，用紫外透射仪观察，并用凝胶成像系统成像。用紫外分光光度计测量总RNA样品浓度，每个3次，取平均值。根据所测浓度，用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1pg/pL，其余样品保存在超低温冰箱备用。总RNA反转录根据TIANGENTIANScriptRTKitcDNA第一链合成试剂盒，其操作步骤如下：在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1—5瞄总RNA,2应oligo(dT)15,2pLdNTP(2.5mMeach),补RNase-freeddH2O定容至13.5pL。70°C加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟，简短离心收集反应液后加入一下各组分：4pL5xFirst-StrandBuffer,1pL0.1MDTT,0.5pLRNasin.力口1pL(200U)TIANScript