分子生物学中心法则

（优选）分子生物学中心法则当前第1页\共有45页\编于星期五\3点Reversetranscription中心法则及补充当前第2页\共有45页\编于星期五\3点第19章DNA复制与修复（一）复制方式：半保留复制。物质基础：双螺旋结构当前第3页\共有45页\编于星期五\3点氮标记技术证实了DNA的半保留复制

以15NH4Cl为唯一氮源培养大肠杆菌，连续培养12代，使所有DNA标记上15N；在普通培养基（14N)培养一代后，所有DNA密度介于14N～15N之间；培养两代后，14N和14N～15N杂合分子等量出现。继续培养，14N分子增多。当前第4页\共有45页\编于星期五\3点(深蓝:15N)(粉红:14N)DNA半保留复制的证据培养于普通培养液继续培养于普通培养液含15N-DNA的细菌普通DNA重DNA第一代中等密度DNA第二代普通DNA中等密度DNA当前第5页\共有45页\编于星期五\3点当前第6页\共有45页\编于星期五\3点当前第7页\共有45页\编于星期五\3点第二节原核生物DNA的复制DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧三核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程。这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与。当前第8页\共有45页\编于星期五\3点一、DNA复制所需原料1）底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP， 总称为dNTP2）DNA聚合酶，DNA-pol3）模板（template）：解开成单链的DNA母链4）引物（primer）：RNA引物5）其他酶和蛋白质因子当前第9页\共有45页\编于星期五\3点1、DNA聚合酶－复制的基本酶作用特点：从引物游离3’－OH开始加入脱氧核苷酸，需要底物，引物，模板，能量，Mg2+。DNA聚合酶为DNA指导的酶。当前第10页\共有45页\编于星期五\3点原核细胞DNA聚合酶539DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

5’→3’聚合活性

+++聚合速度nt/s16~207250~1000对dNTP亲和力

低低高5’→3’外切活性

+-+3’→5’外切活性

+++功能

修复;去除引物；填补空缺

协助修复主要复制酶DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ：与突变存活有关的酶。当前第11页\共有45页\编于星期五\3点DNA-pol的5´3´聚合作用3’5’5’3’3’5’DNA-pol5’3’OHP当前第12页\共有45页\编于星期五\3点DNA-pol

I

5´3´外切活性切除引物，切除突变片段DNA-pol

I

3´5´外切活性：校读（proofread）功能5’3’AG5’3’当前第13页\共有45页\编于星期五\3点小片段大片段（Klenowfragment）5‘→3’聚合功能，3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性DNApolI的酶切片段EJPNMLHIORQGCDBFAK当前第14页\共有45页\编于星期五\3点引物酶(Primase)5´5´DNA合成需在RNA引物的基础上进行。RNA引物5´3´5´3´当前第15页\共有45页\编于星期五\3点解除DNA高级结构的酶与蛋白：DNA复制从起始点开始复制时，局部的DNA双链必须打开，主要靠解螺旋酶（helicase)的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，防止复性。在复制叉向前移动时造成前方DNA分子产生正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。当前第16页\共有45页\编于星期五\3点3、解螺旋酶(helicase)解螺旋酶作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。基因：dnaA、B、C…蛋白：DnaA、B、C…ATP当前第17页\共有45页\编于星期五\3点4、拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）一类能调节DNA分子超螺旋类型和水平的酶。DNA正超螺旋与负超螺旋复制后形成负超螺旋复制前方形成正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶Ⅰ酶Ⅱ，引入负超螺旋当前第18页\共有45页\编于星期五\3点消除复制叉前方形成的正超螺旋，即引入负超螺旋。切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，连接切口。不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ:临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。作用方式：切割DNA链，使其松弛后再连接。当前第19页\共有45页\编于星期五\3点5、DNA连接酶－连接DNA片断的酶连接酶(ligase)的作用是催化相邻的DNA片段以3’、5’－磷酸二酯键相连接。连接反应中的能量来自ATP(动物细胞或噬菌体）或NAD＋（细菌)。连接酶要求催化反应时缺口处有一条链是连续的。不能将两条游离的DNA分子连接起来。当前第20页\共有45页\编于星期五\3点连接酶的催化反应当前第21页\共有45页\编于星期五\3点二、DNA复制过程(544)各种生物DNA的复制过程大同小异，大致包括以下几个阶段。1、起始－有固定的起点（1）识别起始位点

复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originalreplication)常用ori或o表示。多双向、对称等速复制。当前第22页\共有45页\编于星期五\3点大肠杆菌的oriC大肠杆菌染色体DNA复制起始点oriC由245bp组成，关键序列在于两组短的重复：三个13bp和四个9bp组成的保守序列，是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置。当前第23页\共有45页\编于星期五\3点（2）DNA解旋，形成复制叉解旋酶、拓扑异构酶与复制起点结合，解开双螺旋成两条局部的单链，SSB也随即结合上保护单链。（3）RNA引物的合成

引物合成酶结合上去，形成结构复杂的引发体。引物合成酶合成引物。

当前第24页\共有45页\编于星期五\3点起始：OriC开始，形成复杂的引发体，合成RNA引物当前第25页\共有45页\编于星期五\3点2、延伸－酶催化以高速度进行在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，根据模板链3’→5’的核苷酸顺序，从引物游离3’－OH开始加入脱氧核苷酸，直至合成整个DNA片断。酶的催化方向：5’→3’，所以新生DNA链的延伸方向也是5’→3’。两条链复制又同时进行。如何解决？一条链连续合成，称为前导链；另一条链不连续合成，为滞后链。冈崎片断：以DNA5’→3’链为模板时合成的不连续的较短的DNA片断。当前第26页\共有45页\编于星期五\3点’ThemodelofDNA-polIII

formthecatalyticcore

LinkstwocoresLeadingstrandsynthesisLaggingstrandsynthesisactasaclamp当前第27页\共有45页\编于星期五\3点复制过程：两条链同时进行当前第28页\共有45页\编于星期五\3点聚合酶Ⅰ切除引物连接酶连接冈崎片断聚合酶Ⅲ合成冈崎片断当前第29页\共有45页\编于星期五\3点3、终止两复制叉在终止区相遇，形成的连锁体由拓扑异构酶Ⅳ分开。终止子ter和终止蛋白Tus防止复制叉超过终止区过界复制。当前第30页\共有45页\编于星期五\3点当前第31页\共有45页\编于星期五\3点第三节真核生物DNA的复制真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处：多复制起点至少有五种聚合酶αβγδε

端粒的复制依赖于端粒酶

当前第32页\共有45页\编于星期五\3点（1）真核细胞多复制起点当前第33页\共有45页\编于星期五\3点（2）真核生物DNA聚合酶真核生物至少拥有5种DNA聚合酶，分别命名为α、β、γ、δ及ε。能在5’→3’方向聚合DNA链，但功能不尽相同。真核细胞中与DNA复制有关的酶是DNApolα（合成引物）和δ(合成前导链和滞后链）。δ还具有3’→5’外切酶的校正功能，并具有解螺旋的作用。酶β和ε：参与修复。酶γ参与线粒体DNA复制。当前第34页\共有45页\编于星期五\3点（3）端粒及端粒酶真核生物染色体DNA是线性的，每复制一次，子链的5’有缺失。3’端有特殊的序列,是线性DNA末端复制必需的---端粒作用：稳定染色体当前第35页\共有45页\编于星期五\3点线形DNA复制末端问题5’3’5’3’5’3’5’3’当前第36页\共有45页\编于星期五\3点端粒缩短当前第37页\共有45页\编于星期五\3点当前第38页\共有45页\编于星期五\3点第四节反转录逆转录：在RNA指导下DNA的合成。即以RNA为模板，合成DNA的过程。此过程和一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reversetranscriptase)。反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。

当前第39页\共有45页\编于星期五\3点反转录酶的活性

①RNA指导的DNA聚合酶活性：反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。当前第40页\共有45页\编于星期五\3点RNA模板逆转录活性RNaseH活性RNA:DNA杂化双链单链DNADNApol活性整合(integration)入细胞基因组双链DNA

病毒基因组通过基因重组插入到宿主细胞基因组中，称为整合。tRNA引物当前第41页\共有45页\编于星期五\3点逆转录酶将RNA逆转录成双链DNA，与宿主细胞DNA整合，可能导致癌变！病毒DNA随宿主细胞复制，转录生成RNA并翻译成蛋白。RNA和蛋白组装成病毒。当前第42页\共有45页\编于星期五\3点第五节DNA的损伤修复一、DNA的损伤（突变）的概念DNA分子一级结构的改变称为DNA损伤(DNAdamage)或突变（mutation）。自发突变：大多数突变属此类，原因不明。诱发突变：由理化因素诱发物理因素（紫外、高能射线、电离辐射）化学因素（5-F-U，烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）当前第43页\共有45页\编于星期五\3点二、突变的类型1.点突变（pointmutation）