生物技术大实验自制年

生物技术大实验自制年第一页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验原理多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为：在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。第二页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验原理加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。第三页，共四十七页，编辑于2023年，星期日

实验原理第四页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验目的本实验以食蟹猴人芽囊虫虫DNA为模板，设计引物，扩增出1100bp的扩增产物。学习并掌握PCR反应的基本原理与实验技术。第五页，共四十七页，编辑于2023年，星期日器材和试剂器材

PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等第六页，共四十七页，编辑于2023年，星期日器材与试剂试剂：

1、蓝色帽管：天根2×TaqMasterMix(内含TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg＋＋和上样buffer等）

2、白色管：引物1引物2

3、白色管：无菌ddH2O4、模板DNA：人芽囊虫基因组DNA

第七页，共四十七页，编辑于2023年，星期日操作无菌ddH2O8ul2×TaqMasterMix

10ul引物1

0.5ul引物2

0.5ul模板DNA1ul

总体积20ul混匀后，高速瞬时离心，置PCR仪上第八页，共四十七页，编辑于2023年，星期日操作PCR扩增的设定：设置PCR扩增仪的热盖温度为99℃预变性：94℃4min循环：95℃变性45s54℃退火45s35个循环

72℃延伸1min最后延伸：72℃5min产物进行电泳拍照。第九页，共四十七页，编辑于2023年，星期日注意事项由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA，加模板DNA时不要形成喷雾。若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。第十页，共四十七页，编辑于2023年，星期日【思考题】1、PCR反应的原理是什么？2、PCR反应体系包括那些？第十一页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验二质粒DNA的提取第十二页，共四十七页，编辑于2023年，星期日质粒

(plasmid)特点

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。第十三页，共四十七页，编辑于2023年，星期日载体的选择标准能自主复制；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；分子量小，以容纳较大的外源DNA。第十四页，共四十七页，编辑于2023年，星期日第十五页，共四十七页，编辑于2023年，星期日质粒的复制型质粒在细胞内的复制一般有两种类型:严谨型(Stringentcontrol)

：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒松弛型(Relaxedcontrol)

：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。第十六页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。第十七页，共四十七页，编辑于2023年，星期日质粒DNA的分离和纯化质粒提取的主要步骤：细菌的培养细菌的收集和裂解第十八页，共四十七页，编辑于2023年，星期日提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA

RNA第十九页，共四十七页，编辑于2023年，星期日碱裂解法抽提质粒1.质粒提取试剂盒(离心柱型)第二十页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验原理

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀质粒DNA。第二十一页，共四十七页，编辑于2023年，星期日平衡液BL(BufferBL)溶液P1(BufferP1)溶液P2(BufferP2)溶液P3(BufferP3)去蛋白液PD(BufferPD)漂洗液PW(BufferPW)洗脱缓冲液EB(BufferEB)RNaseA(10mg/ml)吸附柱CP3(SpinColumnsCP3)收集管(2ml)(CollectionTubes2ml)[质粒提取试剂盒组成]第二十二页，共四十七页，编辑于2023年，星期日使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。2.漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。3.使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。[实验准备]第二十三页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验仪器与材料（一）仪器：超净工作台，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅（二）材料：1.5ml离心管，加样枪，含有质粒pVAX1的大肠杆菌TOP10、LB液体培养基第二十四页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验步骤1.细菌培养：接种含质粒pVAX1的大肠杆菌TOP10

10μl到10ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中，37℃摇培过夜（10~12h）2.柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上↓12000rpm，1min倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上第二十五页，共四十七页，编辑于2023年，星期日3.收集菌体：取1.5ml菌液转入小离心管中↓12000rpm，1min弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。

4.悬浮：加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低）。↓5.裂解：加250ul溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次,（此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）。(注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。)↓6.中和：加350ul溶液P3

，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀）。↓12000rpm,10min第二十六页，共四十七页，编辑于2023年，星期日7.转移上清：将上清转移到CP3中（注意尽量不要吸出沉淀）↓12000rpm,30-60sec8.漂洗DNA：向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9.重复步骤8。10.去漂洗液：将空吸附柱重新置于收集管上，10000rpm，2min，以除去吸附柱中残余的漂洗液。11.收集质粒：将吸附柱置于一个干净的小离心管上，向吸附膜的中间部位滴加30-50ul洗脱漂洗液EB（或dw），放置2min，12000rpm，2min，离心管中即为收集的质粒溶液，做好标记，低温保存备用。第二十七页，共四十七页，编辑于2023年，星期日DNA的保存

1、短期贮存：

4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。

TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2、长期贮存：置于TE缓冲液中-70℃可保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。第二十八页，共四十七页，编辑于2023年，星期日离心的注意事项1.

重量相等离心管或试管需平衡（称重）2.位置对称平衡好的离心管或试管需对称放置第二十九页，共四十七页，编辑于2023年，星期日实验三质粒DNA的限制性酶切

与鉴定【实验目的】

学习通过限制性酶切法签定阳性克隆的方法原理与技术，熟悉琼脂糖电泳原理及操作。第三十页，共四十七页，编辑于2023年，星期日【实验原理】限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。1、质粒DNA的限制酶切

第三十一页，共四十七页，编辑于2023年，星期日pVAX1酶切位点的分布示意图第三十二页，共四十七页，编辑于2023年，星期日【实验仪器与试剂】一、实验仪器1、微量移液器2、离心机3、恒温水浴箱二、试剂1、EcoRI和HindⅢ2、ddH2O第三十三页，共四十七页，编辑于2023年，星期日第三十四页，共四十七页，编辑于2023年，星期日【实验步骤】在一个洁净的1.5ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（µl）质粒DNA1010×MBuffer2HindⅢ0.5EcoR-I0.5水7总计20第三十五页，共四十七页，编辑于2023年，星期日2、将反应物置于37℃水浴，温浴2小时。3、加入5µl加样缓冲液，混匀后即可加样进行电泳。4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。第三十六页，共四十七页，编辑于2023年，星期日一、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。1、琼脂糖凝胶电泳第三十七页，共四十七页，编辑于2023年，星期日二、试剂与器材电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子取液器溴酚蓝第三十八页，共四十七页，编辑于2023年，星期日试剂1、50×Tris-乙酸-EDTA缓冲液（TAE缓冲液），pH8.3：称取Tris242g，EDTA-Na237.2g溶于800ml去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的乙酸，充分混匀定容至1000mL。2、琼脂糖：1g溶于TAE缓冲液中加热配成100mL。3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×LoadingBuffer）

：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。4、0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）第三十九页，共四十七页，编辑于2023年，星期日5、DNA

Marker（TaKaRa公司）1）DL2,000TMDNAMarker本Marker为已含有1×LoadingBuffer的DNA溶液可取5μL直接电泳第四十页，共四十七页，编辑于2023年，星期日1、水平板型电泳槽2、直流稳压电泳仪3、微量移液枪4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶图像的实时观测器材第四十一页，共四十七页，编辑于2023年，星期日三、操作方法

1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mLTBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。注意要完全融化混匀第四十二页，共四十七页，编辑于2023年，星期日2、凝胶板的制备