《生物化学教程》第三章酶化学解析课件

第三章酶化学

本章内容第一节酶引论第二节酶动力学第三节酶作用机制和酶活性调节第一节酶引论Ferment－－（酵素）Enzyme－－在酵母中（希腊文）Enzyme("inyeast")enzyme是希腊文en=in，

zyme=yeast一、酶研究的简史（了解）对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也（一）酶的早期利用（二）19世纪中叶对发酵本质的探讨1857巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。

1分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2

从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，生成乙醇。1897Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。1913年Michaelis和Menten提出米氏学说—酶促动力学原理。（三）关于酶的化学本质的认识1926年Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。

J.B.SumnerJ.H.Northrop（三）关于酶的化学本质的认识·某些RNA有催化活性（

ribozyme，核酶）

1982年美国T.Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性。ThomasCechUniversityofColoradoatBoulder,USA·1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA的前体加工。SidneyAltmanYaleUniversityNewHaven,CT,USA

Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。（三）关于酶的反应机制的研究

酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质或核酸。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂。（四）酶的概念二、酶是生物催化剂（一）与一般催化剂的相同点1.提高反应速度，不改变平衡点;2.只起催化作用，本身不消耗；

3.降低反应的活化能。（二）酶是催化剂，降低反应的活化能

概念：指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能。

-----------单位：KJ/mol

酶催化反应的实质：降低反应的活化能（三）酶作为生物催化剂的特点酶的催化效率高（高效性）酶的高度专一性（专一性）酶活力受调节和控制（可调性）酶催化反应条件温和，中性pH催化效率高酶的催化效率比化学催化剂高107-1013

倍，比非催化反应高105-1017

倍。(1)过氧化氢分解

2H2O2

→2H2O+O2用Fe3+

催化，效率为6×10-4

mol/mol·S，而用过氧化氢酶催化，效率为6×106mol/mol·S。(2)-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。酶的专一性

酶活力受调节——指通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化能力。酶活力的调节酶活性（活力）的调节酶量的调节（基因表达的调控）别构调节共价调节反馈抑制（顺序）反馈抑制（协同）三、酶的化学本质（一）酶的化学组成酶单纯酶（简单蛋白质）缀合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子单纯酶单纯酶（simpleenzyme）仅由氨基酸组成。例如：胃蛋白酶，淀粉酶，核糖核酸酶，脲酶。

缀合酶有的酶属于缀合蛋白质，除了蛋白质组分外还有非蛋白组成，即缀合酶。羧肽酶NADPH—脱氢酶的辅酶过氧化氢酶（二）酶的辅助因子

酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。辅助因子辅酶

与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基

与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂

金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。重要的例子：(1)传递电子体：如卟啉铁、铁硫簇；(2)传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD/NADP、CoQ、硫辛酸；(3)传递酰基体：如CoA、TPP、硫辛酸；(4)传递一碳基团：如四氢叶酸；(5)传递磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：转氨基，如VB6；传递CO2，如生物素。小结：1、全酶由

和

组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中

决定酶的专一性和高效率，

起传递电子、原子或化学基团的作用。思考题:2、具有生物活性的全酶，无辅助因子时

A.有活性B.无活性C.无特异性D.不易失活3、T．R．Cech和S.Alman因各自发现了

而共同获得1989年的诺贝尔奖（化学奖）。（三）酶的四级缔合（了解）根据酶蛋白分子的特点：单体酶：一般由一条肽链组成寡聚酶：为寡聚蛋白，≥2个亚基多酶复合体：几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。-------由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）溶菌酶（单体酶）丙酮酸脱氢酶复合体1：酰基转移酶（AT）2：丙二酰转移酶(MT)3：β－酮脂酰-ACP合成酶(KS)4：β－酮脂酰-ACP还原酶(KR)5：β－羟脂酰-ACP脱水酶(HD)6：β－烯脂酰-ACP还原酶(ER)7：酰基载体蛋白（ACP）大肠杆菌中的FA合成酶四、酶的命名和分类（一）酶的命名2、国际系统命名法(systematicname)1、习惯命名法(recommendedname)1、习惯命名法(recommendedname)根据其催化底物来命名(蛋白酶；淀粉酶）；根据所催化反应的性质来命名（水解酶；裂解酶）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点（胃蛋白酶、胰蛋白酶)2、国际系统命名法(systematicname)国际系统命名法原则，是以酶所催化的整体反应为基础，规定每一种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，则两个底物都应写出，中间用“：”号隔开。（国际酶学委员会１９６１年提出）<<EnzymeHandbook>>ThomsE.Barm编例如：习惯名称:谷丙转氨酶(GPT,ALT)系统名称:L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:-酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸

+丙酮酸（二）酶的分类和编号（掌握）1.国际系统分类法分类原则六大类酶的记忆诀窍：氧转水，裂亦连氧化还原酶转移酶水解酶裂解酶异构酶连接酶2.六大酶类的特征（1）氧化还原酶Oxidoreductase氧化还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶和氧化酶，辅酶为NAD或NADP,FAD或FMN.反应通式：AH2+B→A+BH2CHOCHOHCH2OP+NAD++PiCO~CHOHCH2OPPO+NADH+H+甘油醛－3－磷酸脱氢酶甘油醛－3－磷酸甘油醛－1，3－二磷酸（2）转移酶Transferase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。反应通式：AR+B=A+BR

α－酮戊二酸L－谷氨酸α－酮酸（3）水解酶hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。AB+H2O=AOH+BH（4）裂解酶Lyase催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。反应通式：AB=A+B

（5）异构酶

Isomerase催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。反应通式：A←→BOCH2OHHOOHOHOHP磷酸己糖异构酶OCH2OHOCH2POHOH果糖－6－磷酸葡萄糖－6－磷酸（6）连接酶LigaseorSynthetase催化两个分子合成一个分子的反应，通常与ATP的裂解反应相耦联。反应通式：A＋B+ATP←→AB+ADP+Pi

在每一大类酶中又可根据不同的原则，分为几个亚类。每一个亚类再分为几个亚亚类。最后，再把属于每一个亚亚类的各种酶按照顺序排好，分别给每一种酶一个编号。酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚类中的序号

例如：乳酸脱氢酶(EC1．1．1．27)。练习题：1、根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可分为六类为——、——、——、——、——和——。2、根据国际酶学委员会的规定，每一种酶都有一个唯一的编号。醇脱氢酶的编号是EC1.1.1.1，EC代表

，4个数字分别代表

、

、

和

。国际酶学委员会酶的分类亚类亚亚类在亚亚类中的编号五、酶的专一性（一）酶对S的专一性酶的专一性的类型结构专一性绝对专一性相对专一性立体专一性几何异构专一性旋光异构专一性族（基团）专一性键专一性酶的专一性（二）关于酶专一性的假说三点附着学说①

三点附着学说认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。②“锁钥”学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。刚性模式：EmilFisher提出③诱导锲合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.柔性学说：Koshland提出Theinduced-fitmodel诱导锲合学说六、酶活力的测定（重点）（一）酶活力与酶促反应速度1.酶活力概念：酶催化一定化学反应的能力。实质：酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。即用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。2、表示方法产物浓度变化曲线用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？反应初速度Vo反应初速度表示酶活力（二）酶活力单位常用的酶活力单位有三种：1、国际单位(IU)

由国际酶学委员会规定在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化1mmol

底物转化所需的酶量定义为1个国际单位(IU)。

单位：μmol●min-1某酶在一定条件下，5min内使30mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？思考题：30mmol————＝

5min30000μmol————＝6000IU5min2、Katal是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位在最适条件下，酶每秒钟催化1mol底物转化所需的酶量定义为1个Kat

。

1Kat=60×106IU1Kat=6×107IU

3、自定义的活力单位（了解）这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。

酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位。有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化(DA/t)表示酶活力单位。①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。1、有1g淀粉酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取出1ml测定酶活力，测知每5min分解0.25g淀粉。(淀粉酶活力单位的定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量为1U)求1g酶制剂中所含有的淀粉酶活力单位数?思考题：由题意每小时分解1克淀粉的酶量为1U，1ml酶液5min水解0.25g淀粉得出：1ml该酶液1小时可以水解淀粉（12×0.25）g＝3g，则1ml酶液含活力单位数为3U，那么1g酶制剂含活力单位数为3U/ml×1000ml＝3000U。（三）酶的比活力1、酶的比活力指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数比活力＝酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）比活力是酶制剂纯度的常用指标——比活力越大，表示酶越纯有50μg纯酶制剂，5min内催化生成了4μmol产物，计算酶的活力及比活力。思考题：酶的活力=44=

0.8IU

5酶的比活力=0.8×10004=

16

U/mg

502、产率与纯化倍数纯化倍数

=每次比活力/第一次比活力产率

=每次总活力/第一次总活力×100%

不同样品同一酶制剂的总活力、总蛋白、比活力比较

纯化进程甲乙丙丁总活力6432总蛋白(mg)201052比活力(U/mg)6/204/103/52/2

从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？思考题：第一次酶的比活力=

360

=

2.4

150最后酶的比活力=

288

=

3600

0.08产率

=每次总活力/第一次总活力×100%

＝288/360＝80％纯化倍数

=每次比活力/第一次比活力＝3600/2.4=1500P147第10题

某酶的粗提液经过一次纯化后测得数据如下表所示：步骤体积/mL总蛋白/mg单位体积活力/（IU/mL）细胞匀浆（粗提液）100100020亲和层析510300

试计算该酶的比活力、纯化倍数和回收率？最终酶的比活力=(300×5)/10=150IU/mg最初的比活力=(20×100)/1000=2IU/mg纯化倍数=150/2=75回收率=（300×5）/（20×100）=75%（五）酶活力的测定（了解）

测定完成一定反应所需的时间测定单位时间内酶催化的化学反应量（1）分光光度法：利用底物/产物光吸收性质不同选择适当波长来测定。（2）荧光法：利用底物/产物荧光性质的差别。紫外/可见光（3）同位素测定方法：放射性同位素标记底物，经酶作用得到相应产物，经适当分离，测定产物脉冲数即可。（4）电化学法：包括pH测定法，离子选择电极法等。前者跟踪反应过程中H+的变化，后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。七、核酶-非蛋白质生物催化剂（一）核酶的发现（ribozyme））核酶是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些被DNA分子同样具有催化功能。（二）核酶的种类（自我催化）剪切型核酶（self-cleavage）

--------是转录后加工方式之一剪接型核酶（self-splicing）

--------剪切与连接需要鸟苷和Mg2+参与不需要鸟苷的参与

其他类型-----如核苷酸转移，脱磷酸作用（三）核酶的研究意义①RNA可作为生物催化剂。②打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。③为进化先有核酸、先有RNA提供证据。④可用于制药和临床治疗。内容回顾

酶的活力及比活力及如何计算指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数比活力＝酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）第二节酶动力学酶促反应动力学

研究各种因素对酶促反应速度的影响。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。酶动力学一、有关的化学动力学概念（了解）

化学反应的两个基本问题：反应进行的方向、可能性和限度---化学热力学反应进行的速率和反应机制----化学动力学1.反应分子数反应中真正相互作用的分子的数目单分子反应：A→P双分子反应：A+B→P+Q2.反应级数能以v=kc表示，为一级反应；能以v=kc1c2表示，则为二级反应；v与反应物浓度无关，则为零级反应。双分子反应、一级反应二.底物浓度对酶促反应速率的影响（一）中间复合体学说研究前提单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（[S]》[E]）1.中间复合体学说E+SESP+Ek1k2k3

k4三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（3）P→0忽略这步反应++中间复合体学说2.底物浓度对酶促反应速度的影响在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。E+Sk1k2k3ESE+P[S]VVmax当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax（二）酶促反应动力学的基本公式—米-曼氏方程1、米氏方程及其推导

1913年Michaelis和Menten在快速平衡理论的基础上提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)，1925年Briggs和Haldane在稳态平衡理论的基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。[S]：底物浓度V：反应速度Vmax：最大反应速度Ｋm：米氏常数1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──米氏方程的推导令：将（4）代入（3），则：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由[ES]决定，即，所以(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于稳态时：当[Et]=[ES]时，(4)所以

米氏常数最大反应速度a.当[S]很小时V=V[S]/Km一级反应反应初速度随底物浓度变化曲线米氏曲线V=V[S]Km+[S]b.当[S]很大时V=V[S]/[S]=V

0

级反应混合级2、米氏方程所确定的曲线3、Km值的推导、定义及意义当反应速度为最大反应速度一半时Km＝[S]*Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2

Km的意义Km值是酶的特征性常数之一，但不同条件下具有不同的Km值。Km值可表示酶与底物之间的亲和程度同一种酶对不同底物有不同的Km值，可帮助推断某一代谢反应的方向和途径Km=

k2+k3k1Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，亲和力越强。[S]很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要k2>>k3时Km值表示酶与底物之间的亲和程度Km值可以判断酶的专一性和天然底物：有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，也就是天然底物。

Km愈小，达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小，底物最适。Km值表示酶与底物之间的亲和程度Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径在可逆反应中，两个Km值中最小的反应方向是该酶促反应的主要方向.如果代谢途径各酶的Km已知，Km最大的酶是限速酶.4、Vmax和k3（kcat)的意义定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成

正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数，即动力学常数K3。即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。

底物浓度对酶促反应速率的影响[S]VVmax内容回顾Km的概念及意义

概念：当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度.

物理意义：酶的特征性常数，只有酶的性质有关，与酶的浓度无关.5、Km和Vmax的测定（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法将米氏方程改写成：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km（2）v对作图（Eadie-Hofstee法）Eadie-Hofstee方程式：（3）[S]/v对[S]作图（Hanes-Woolf法）小结米氏方程①

根据下图所给出的动力学数据，查出该酶的Km值是多少？（）思考题：-4-2024676543211/[S]1/v②借助米-曼氏方程υ＝Vmax[S]/(Km＋[S])研究底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是，在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下，方程呈什么形式？①当〔S〕=Km时；②当〔S〕>>Km时；③当〔S〕<<Km时。

③米氏常数随酶浓度增加而变大。（）④酶促反应的米氏常数与所催化反应的底物无关（）.三.多底物的酶促反应（了解）1.酶促反应按底物分子数分类

分为单底物、双底物和三底物反应2.多底物反应按动力学机制分类（1）序列反应或单－置换反应①随机单置换反应（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应AB②有序反应（orderedreactions）领先底物释放释放A和Q竞争地与自由酶结合(2)乒乓反应或双置换反应

AAEPE’PEE’

QEQEBB

A和Q竞争自由酶E形式

B和P竞争修饰酶形式E’A和Q不同E’结合

B和P也不与E结合。AQ3.双底物反应的动力学方程（1）序列机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A与酶结合的解离常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率四、

影响酶促反应速率的其他因素影响酶促反应速度的因素：酶浓度[E]底物浓度[S]pH反应温度激活剂A抑制剂I

酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，反应速度与酶浓度成正比。0V[E]关系式为：V=K3[E]（一）pH对酶促反应的影响1、酶反应的最适pH在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH。钟罩形

酶的最适pH不是一个固定的常数，它受到底物的种类、浓度;缓冲液的种类、浓度;酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。例:碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时[s]为2.5x10-5M，最适pH为8.3[s]为2.5x10-2M，最适pH为10.02、pH影响反应速度的原因极端的pH引起酶蛋白的变性，因而使酶的活力丧失；pH的改变影响酶分子上酸性及碱性AA残基的侧链基团的解离状态；pH的改变也影响底物的解离状态。（二）温度对酶促反应的影响上图反映出温度如何影响酶活力？产物累积量相对酶活力％

最适温度

最适温度动物酶

35~40℃植物酶40~50℃微生物大部分

40~50℃个别高温菌90℃以上最适温度（optimumtemperature）酶表现活力最大时的温度为最适温度

最适温度不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度,溶液的离子强度,pH,反应时间等的影响。例:反应时间短，最适温度高。反应时间长，最适温度低。（三）激活剂对酶促反应的影响1、概念：使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。

2、种类：大多数的无机离子、一些小分子的有机化合物以及生物大分子。

-必需激活剂(essentialactivator)-非必需激活剂(non-essentialactivator)五、酶的抑制作用（重点）（一）抑制作用的概念1、概念凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性。失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。2、抑制与失活的比较3、抑制程度的表示方法（了解）（1）相对活力ViV0Vi：有I存在下的反应初速率V0：无I时的初速率2.抑制分数——指被抑制而失去活力的分数ViV0（二）抑制作用的类型（掌握）根据抑制作用是否可逆:

1）不可逆抑制作用:

抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用.

2）可逆抑制作用:

抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是可逆的.（三）可逆性抑制作用三种类型竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制1、竞争性抑制（1）竞争性抑制作用定义：抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争性抑制

剂（2）竞争性抑制剂的动力学曲线SSEEIIEE+P无I

有I

竞争性抑制的底物浓度曲线v

竞争性抑制作用过程[S]抑制剂常数有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值随[I]的增高而增大；在[E]固定时，当[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。竞争性抑制作用的速度方程：v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km竞争性抑制动力学曲线（3）竞争性抑制作用的特点I与S分子结构相似；

Vmax不变，Km增大；抑制程度取决于I与E的亲和力以及[I]和[S]的相对比例；增大[S]可减轻或消除抑制作用.（4）竞争性抑制作用的例子琥珀酸延胡索酸草酸盐草酰乙酸丙二酸戊二酸琥珀酸脱氢酶FAD例1:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制例2：磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制例3.抗代谢物的抗癌作用内容回顾：

底物浓度对酶促反应速度的影响

酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，反应速度与酶浓度成正比。0V[E]关系式为：V=K3[E]根据抑制作用是否可逆:

1）不可逆抑制作用:

抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用.

2）可逆抑制作用:

抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是可逆的.

抑制剂对酶促反应速度的影响可逆性抑制作用三种类型竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制1、竞争性抑制竞争性抑制作用定义：抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竞争性抑制动力学曲线2、非竞争性抑制概念抑制剂与酶分子活性中心以外的必需基团结合而抑制酶活性，I和S之间不存在竞争关系。（1）非竞争性抑制作用非竞争性抑制剂SSEEEE+PSESIIII（2）非竞争性抑制作用的动力学曲线经推导后得方程:有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；Km值不变。非竞争性抑制作用的速度方程：非竞争性抑制的动力学方程:1v=KmVmax(1+

)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+

）[I]Ki非竞争性抑制的特征曲线：1v正常[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki

非竞争性抑制动力学曲线（3）非竞争性抑制作用的特点I与S分子结构不同；Vmax减小，Km不变；抑制程度取决于[I]大小。不能通过增大[S]的方法来消除3、反竞争性抑制（1）反竞争性抑制作用

抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。（2）反竞争性抑制作用的动力学曲线有反竞争性抑制剂存在时，Km和Vmax值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。

反竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km+(1+[I]/Ki)[S]1v=KmVmax(1+)[I]Ki1[S]1Vmax

反竞争性抑制的特征曲线：[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km[I]Ki+(1+)-1Km1Vmax(1+)[I]Ki

反竞争性抑制动力学曲线（3）反竞争性抑制作用的特点I与S分子结构不同,I只与ES结合

Vmax和Km都减小；抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度。底物的存在是抑制剂与酶结合的先决条件总结小结：不同类型可逆抑制作用的米氏方程和常数小结：Km变大、Vmax不变截距Km不变、Vmax变小Km、Vmax都变小（四）酶抑制剂应用举例1.不可逆抑制剂的概念及类型概念：抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性.

非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂

非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）

专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）①非专一性不可逆抑制剂-OH例1：巯基酶的抑制

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S解毒方法：

SEHg+

SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+Hg

SHCOONaCHS

CHSCOONa二巯基丁二酸钠例2：羟基酶的抑制有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)酸ROOROO—E磷酰化酶(失活)OOROOR+E—OH解磷定②专一性不可逆抑制剂特点：抑制剂只作用于酶蛋白分子中一种AA侧链基团或仅作用于一类酶。Ks型不可逆抑制剂Kcat型不可逆抑制剂类型：根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶的活性。

类型一：Ks型不可逆抑制剂（亲和标记型）

二者有相似的结构，TPCK可以与胰蛋白酶活性部位必需基团His57共价结合，引起不可逆地失活。TLME（对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯）TPCK（对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮）Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）与底物结构类似，但分子中还有潜伏的反应基团。当它与底物结合后，其潜伏的反应基团被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，使酶遭受抑制。此类抑制剂亦称酶的自杀性底物。

Hg2+对酶的抑制作用可用下列哪种方法解除?

A：提高底物浓度B：对pH7.4磷酸盐缓冲液进行透析C：使用解磷定D：使用二巯基丙醇思考题：2、

可逆抑制剂应用的例子（1）竞争性抑制剂的例子利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药抗菌机理：------与对氨基苯甲酸是结构类似物竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖。人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。3、可逆和不可逆抑制作用的鉴别反应体系不加I体系中加入一定量不可逆抑制剂体系中加入一定量可逆抑制剂v123[E][E]v不可逆抑制剂的作用[E]v可逆抑制剂的作用[I]→[I]思考题：如何根据酶反应速度与酶浓度的关系作图区分可逆抑制剂与不可逆抑制剂？1、可逆抑制作用2、不可逆抑制作用3、两种抑制剂有不同的动力学曲线[E]v不可逆抑制剂的作用[E]v可逆抑制剂的作用[I]→[I]第三节酶作用机制和酶活性调节第三节酶作用机制和酶活性调节一、酶的活性部位及其确定方法二、酶促反应机制三、酶促反应机制的举例四、酶活性的别构调节一、

酶的活性部位及其确定方法1、酶的活性部位（或中心）（1）概念：指酶分子中直接参与和S结合，并与酶催化作用直接相关的部位。（2）类型：结合部位和催化部位结合部位：参与S结合的部位，决定酶促反应的专一性；催化部位：直接参与催化反应的部位，决定酶促反应的性质.活性中心的结合部位SE活性中心的催化部位（3）结构特征占据的空间位置很小，一个三维实体；活性中心的构象具有柔韧性和可塑性；活性中心AA残基一级结构可能相距很远，通过肽链折叠空间构象上靠近；活性部位是E分子表面的一个空穴或裂沟（疏水空穴）.通过次级键与底物结合，并与底物诱导契合。活性中心AA残基一级结构可能相距很远，通过肽链折叠空间构象上靠近溶菌酶2、维持活性所必需的氨基酸残基酶的必需基团：概念：与酶的催化活性直接相关的化学基团，若经化学修饰则酶的活性丧失。类型：His的咪唑基、Ser的-OH、Glu的侧链-COOH、Cys的-SH.小结：活性部位与必需基团的关系必需基团活性部位维持酶的空间结构结合部位催化部位专一性催化性质3、活性中心存在的实验证明（了解）切除法化学修饰法亲和标记法X-射线衍射技术化学修饰法原理：用某些化学试剂与酶分子侧链基团以共价键结合，观察酶的活性改变，以确定活性中心的氨基酸残基。如果共价修饰后酶活性不受影响，则修饰的氨基酸残基不是活性中心内；如果酶活性丧失或降低，则修饰的氨基酸残基可能位于活性中心内。举例：胰凝乳蛋白酶的活性中心的确定丝氨酸蛋白酶DFP二异丙基氟磷酸亲和标记法原理：根据E与S能特异性结合的性质，设计合成一种含有反应基团的S类似物，可与S一样进入E的活性中心，通过共价结合而使酶失去活性.+

X-Y3－9胰凝乳蛋白质酶的亲和标记法测定活性中心S对甲苯磺酰－L-苯丙氨酸氯甲酮X-射线衍射技术二.酶促反应机制基元催化的分子机制酶具有高催化能力的原因酸碱催化共价催化金属离子催化邻近和定向效应诱导契合和底物形变电荷极化和多元催化疏水的微环境的影响（一）基元催化的分子机制（了解）1.基元催化的概念---由某些基团或小分子催化反应的，包括酸碱催化、共价催化和金属离子催化。亲电催化剂----缺电子的原子或基团，倾向于从S的多电子基团接纳电子。亲核催化剂----具有未共享电子对的基团，倾向于向S的缺电子的核提供电子。2.酸碱催化

通过暂时性地向S提供H+或从S接纳H+以稳定过渡态的一种催化机制。特殊的酸碱催化-------OH-与H+的反应一般或广义的酸碱催化

为Tyr248为Arg145为Glu270为底物Zn羧肽酶活性中心示意图

3.共价催化亲电基团------Mg2+、Mn2+

（有空轨道）亲核基团------——酶活性中心亲电/亲核基团参与S敏感键断裂的机制。¨-OH¨-SH(有孤对电子)4、金属离子催化（1）金属酶(metalloenzyme)含紧密结合的金属离子（常为活性中心的组成部分）（2）金属激活酶(metal-activitedenzyme)含松散结合的金属离子1)金属离子作为辅助因子的酶的分类羧肽酶Zn2+2）金属离子催化作用的机制

提高水的亲核性能

电荷屏蔽作用

电子传递中间体（二）酶具有高催化能力的原因

1、邻近与定向效应

2、诱导契合与底物形变

3、电荷极化和多元催化

4、疏水的微环境的影响1、邻近与定向效应靠近电性吸引、疏水作用定向底物酶一个分子间的反应变成了一个类似分子内的反应2、诱导契合与底物形变诱导互补性结构变化契合活性中心催化基团进行催化能否契合—专一性的由来+-+-稳定的底物通过电荷等相互作用，底物张力变形激活形成过渡态张力与形变

-

-++3、电荷极化和多元催化胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从Ser转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物酶分子的活性中心是位于非极性的空穴中。非极性的空穴有利于提高酶促底物反应速度。4、疏水的微环境的影响

疏水性“口袋”效应疏水口袋肽链底物三.酶促反应机制的举例1、羧肽酶A的结构及催化机理活性中心必需的氨基酸：Glu270、Arg71、Arg127、Arg145、Tyr248金属离子：Zn2+催化机制：诱导契合、锌离子的亲电催化、酸碱催化以及Arg127的静电吸引作用羧肽酶A＋羧肽酶催化中的电子云形变

C＋=O－靠近电子云形变定向极性专一性契合区H2+N＝C精氨酸C端确认区注意＋羧肽酶A的催化机理2、胰凝乳蛋白酶的催化机理底物：选择性降解带芳香环侧链的氨基酸和大的疏水侧链的氨基酸活性中心的必需氨基酸：Ser195、His57、Asp102催化机制：一般的酸碱催化和共价催化3、烯醇化酶——作用需要金属离子2-磷酸甘油酸磷酸烯醇丙酮酸烯醇化酶碱催化稳定中间产物酸催化四.酶活性的别构调节1、别构调节和别构酶别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。别构酶：具有别构现象的酶。别构剂：能使酶分子发生别构作用的物质。活性中心调节中心2、协同效应（1）概念：当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的协同效应。如果对相邻亚基的影响是导致其对配体的亲和力增加，则称为正协同效应；反之，则称为负协同效应。如果是同种配体所产生的影响，则称为同促协同效应。如果是不同配体之间产生的影响则称为异促协同效应。（2）类型3、别构酶的特点（1）一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括催化部位和调节（别构）部位；（2）具有别构效应（3）别构酶的底物浓度对酶促反应速度的曲线不符合米氏方程，呈“S”形曲线。S曲线：正协同＜81—V↑随［S］↑而加快

双曲线：负协同＞81—V↑随［S］↑而减慢4、别构酶与米氏酶的区别怎么区分米氏酶与别构酶？（1）Koshland建议用饱和比值（saturationratio,Rs）典型的米氏酶RS=81

具有正协同效应的别构酶RS<81具有负协同效应的别构酶

RS>81V=Vm[S]Km+[S]当V=90％Vm0.9Km=0.1[S]［S］＝9Km当V=10％Vm［S］＝1/9Km[s]10%Vm[s]90%Vm=81正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较2米氏曲线1负协同3正协同321V10%V90%V0[S]V（2）目前常使用Hill系数区分米氏酶与别构酶Hill方程:将Hill方程中的有关参数换成别构酶中的有关参数n为Hill系数，米氏酶Hill系数n=1正协同效应的别构酶n>1负协同效应的别构酶n<1内容回顾：第三节酶作用机制和酶活性调节一、酶的活性部位及其确定方法二、酶促反应机制三、酶促反应机制的举例四、酶活性的别构调节四、酶活性的别构调节1、别构调节和别构酶2、协同效应3、别构酶的特点（寡聚酶、S曲线）4、别构酶与米氏酶的区别（Rs，Hill系数）5、别构酶的例子（ATCase）5、别构酶的例子天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase（1）催化的反应途径终产物（2）酶的结构特征完整的酶分子催化亚基调节亚基(活性形式)(三聚体)(二聚体)

3×2+2×3=12个亚基C6R6C6R6（3）调节机制整体上产生激活、抑制现象改变了调节的敏感区位置别构酶能在很小的浓度（底物、调节物）范围内严格控制酶活力，因此是生物代谢中许多关键反应的酶。别构激活别构抑制V0[S]底物敏感区别构激活和别构抑制作用曲线CTP对ATCase别构抑制作用曲线降低酶与底物的亲和力，不改变VmaxATP对ATCase别构抑制作用曲线6、别构酶的调节机制（了解）序变模型（KNF模型）齐变模型（MWC模型）（1）序变模型（KNF模型）1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。该模型的要点:这种假说主张酶分子中的亚基结合小分子物质（底物调节物）后，亚基构象逐个地依次变化，因此亚基可能有各种状态，如下图：（2）齐变模型（MWC模型）1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。该模型的要点:这种模型主张别构酶的所有亚基，或者全部呈坚固紧密的、不利于结合底物的“T”状态，或者都是松散的、有利于结合底物的“R”状态。这两种状态间的转变对于每个亚基都是同时、齐发进行的。“T”状态中亚基的排列是对称的，变成“R”状态后亚基的排列仍然是对称的。如下图：序变模型SSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSS高活性低活性SS齐变模型小结：别构机理五、

酶活性的共价调节1、共价修饰调节概念及类型概念：可通过共价修饰使酶分子结构发生改变，从而引起催化活性发生变化的调节方式.类型：可逆磷酸化、可逆腺苷酰化、尿苷酰化