《DNA重组技术的基本工具》课件1

专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。一、基因工程的概念：

一、基因工程的概念：

别名原理操作环境操作对象操作水平基本过程最终目的基因重组生物体外基因/DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达定向改造生物的遗传性状基因拼接技术、DNA重组技术基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论

摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。1、基因转移载体的发现2、工具酶的发明3、DNA合成和测序技术的发明4、DNA体外重组的实现5、重组DNA表达实验的成功6、第一例转基因生物的问世7、PCR技术的发明（二）技术发明：基础理论和技术发展催生了基因工程基因工程的产物问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？1.1DNA重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞一、DNA重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出约4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”T磷酸二酯键1234512345ADNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”思考：在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？现今存在的生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一种稳定状态？怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？防止外来病原物的侵害。当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。思考与探究为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子.④作用特点：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成⑤限制酶的识别序列：⑥结果:形成两种末端粘性末端平末端一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”限制酶的识别序列：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的GCTTAAGCTTAAEcoRⅠ识别特定核苷酸序列SmaⅠGCGCGCGCGGCC中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。序列特点：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制性核酸内切酶基因的剪刀——限制性核酸内切酶基因的剪刀——限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶

EcoRⅠ黏性末端黏性末端

EcoRⅠ黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？

当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。SmaⅠ平末端平末端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？（被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？）会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。DNA连接酶──“分子缝合针”切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.作用：二、“分子缝合针”——DNA连接酶作用过程：催化磷酸二酯键形成作用原理：CTTAAGAATTCG连接酶BACK类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶DNA聚合酶……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板二、DNA连接酶——“分子缝合针”外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？三、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”导入过程需要运输工具——载体。载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。作为载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）。4）必须是安全的。5)大小应适合。三、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车”3.载体的种类：⑴质粒（最常用）⑵λ噬菌体的衍生物⑶某些动植物病毒常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别抗Amp含有Amp的培养基假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？思考：假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？思考：导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。作为载体没有切割位点将怎样？载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？如果载体上有遗传标记基因，这样，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？载体对受体细胞有害，将影响受体细胞新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。模拟操作：重组DNA分子的模拟操作注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。27483615小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具具备的条件结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具标记基因质粒、噬菌体

、动植物病毒2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？思考与探究P73、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P7随堂练习1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C2.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是

A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种

B、重组DNA的形成在细胞内完成

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、质粒都可作为运载体答案：BD3、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNA答案：D4、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）

A.同种限制酶B.两种限制酶

C.同种连接酶D.两种连接酶A5、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与运载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达C6.同一种限制酶切割成的黏性末端是（）A.①②B.①③C.①④D.②③A7.下列说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的