聚合酶链式反应

第三章聚合酶链式反应

（polymerasechainreaction,PCR）王晓华当前第1页\共有108页\编于星期五\11点聚合酶链反应又称体外DNA扩增技术。是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。当前第2页\共有108页\编于星期五\11点在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进行分析、鉴定。当前第3页\共有108页\编于星期五\11点目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子当前第4页\共有108页\编于星期五\11点

通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。当前第5页\共有108页\编于星期五\11点70年代的初期由Dr.H.Klenow发现了较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli；1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的Taqpolymerase，它的特性能耐高温。80年代之后它被广泛运用；1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术；1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的发现当前第6页\共有108页\编于星期五\11点KaryBMullis

(1944-)

1983年提出PCR方法

1993年度诺贝尔化学奖当前第7页\共有108页\编于星期五\11点一、PCR基本原理PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。依据DNA半保留复制的机理。PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。第一节PCR技术的原理和特点当前第8页\共有108页\编于星期五\11点细胞内复制的过程1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。当前第9页\共有108页\编于星期五\11点Denaturing95˚CAnnealingTm-5˚CExtension72˚CPCR的原理当前第10页\共有108页\编于星期五\11点PCR的基本过程1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的DNA称为模板）

。2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。5’5’3’3’编码链3’端引物5’端引物3’3’当前第11页\共有108页\编于星期五\11点3.延伸：将温度升到75℃左右，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种

dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。5’5’3’3’5’DNA聚合酶5’当前第12页\共有108页\编于星期五\11点Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。当前第13页\共有108页\编于星期五\11点PCR的扩增效应理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加106倍。当前第14页\共有108页\编于星期五\11点PCR产物的积累规律PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。当前第15页\共有108页\编于星期五\11点琼脂糖凝胶电泳PCR产物的鉴定、提取当前第16页\共有108页\编于星期五\11点

PCR

DNA复制部位：DNA体外合成放大过程生物体内DNA合成引物：DNA引物RNA引物（作为新链的一部分）（复制终止时被切除）催化酶：TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5’→3’核酸外切酶有5’→3’核酸外切酶无3’→5’核酸外切酶有3’→5’核酸外切酶基本过程：每循环一次包括复制起始、链延伸和变性、退火、延伸终止三阶段反应实质：扩增靶DNA合成子代DNA当前第17页\共有108页\编于星期五\11点PCR仪聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。当前第18页\共有108页\编于星期五\11点当前第19页\共有108页\编于星期五\11点当前第20页\共有108页\编于星期五\11点PCR仪越快，越精确，越昂贵当前第21页\共有108页\编于星期五\11点ABI7500实时荧光定量PCR仪

普通梯度PCR仪当前第22页\共有108页\编于星期五\11点当前第23页\共有108页\编于星期五\11点二、PCR技术的特点1.高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。当前第24页\共有108页\编于星期五\11点2.高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。①引物与模板DNA特异正确的结合；

②遵循碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。当前第25页\共有108页\编于星期五\11点引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。基因组当前第26页\共有108页\编于星期五\11点3.适用样品的广泛性：

对样品的要求并不十分严格：

1)可以是DNA，也可以是RNA

2)可以是纯化的，也可以是粗制的3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织4)可以是细胞，也可以是体液4.

操作简便、快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

当前第27页\共有108页\编于星期五\11点三、参与PCR反应体系

的因素及其作用模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+缓冲液反应温度循环次数PCR仪等

PCR体系当前第28页\共有108页\编于星期五\11点（一）模板—核酸

1.模板：指能扩增靶DNA片段的核酸2.DNA是直接模板，RNA是间接模板

RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA，cDNA作为PCR扩增的模板。这个技术称为逆转录PCR（RT-PCR）。当前第29页\共有108页\编于星期五\11点病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。考古标本：残留有核酸物质3.常见的扩增对象(含核酸的标本)：当前第30页\共有108页\编于星期五\11点4.避免有影响扩增反应的物质存在如：核酸酶：降解DNA、RAN

蛋白酶：降解TaqDNA聚合酶血红素、抗凝剂：抑制TaqDNA聚合酶活性理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板。

当前第31页\共有108页\编于星期五\11点人基因组DNA0.1-1μg大肠杆菌基因组DNA10-100ngλDNA0.5-5ng质粒DNA0.1-10ng5.模板量要合适，一般为102~105拷贝。50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量当前第32页\共有108页\编于星期五\11点（二）引物1）引物：2条人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。1.引物的性质和作用当前第33页\共有108页\编于星期五\11点2）引物的序列：根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。5’端引物：与模板链的5’端序列相同；3’端引物：与模板链的3’端序列互补。5’5’3’3’模板链3’端引物5’端引物3’3’当前第34页\共有108页\编于星期五\11点3)

引物决定PCR扩增产物的特异性和

长度。4)引物设计决定PCR反应的成败。特异性：引物只针对DNA的一个特定序列互补结合，因此2条引物与DNA模板特异性结合决定了要扩增的DNA区域。长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的部位。当前第35页\共有108页\编于星期五\11点2.引物设计的基本要求1）引物长度要合适，一般为16～30个核苷酸，常用20bp左右。引物过短：会影响PCR的特异性；增加一个核苷酸，特异性提高4倍引物过长：需提高相应的退火温度，若超过延伸温度即TaqDNA酶的最适温度，则影响PCR反应产物。当前第36页\共有108页\编于星期五\11点2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物与模板的结合。GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。3）ATCG4种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。当前第37页\共有108页\编于星期五\11点6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增。7）引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引物3’端最佳碱基选择是G和C。8）引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等9）引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。当前第38页\共有108页\编于星期五\11点5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。3’3’5’GC当前第39页\共有108页\编于星期五\11点3.引物的使用要求

引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1～0.5µmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

合适的退火温度比引物本身的Tm低5℃，一般在55℃左右。当前第40页\共有108页\编于星期五\11点（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性。（天然酶）另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶）TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。当前第41页\共有108页\编于星期五\11点(一)酶活性与热稳定性1）酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。

2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。当前第42页\共有108页\编于星期五\11点1）TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+浓度，优化浓度一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。4）适当浓度的KCl能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%。(二)离子依赖性当前第43页\共有108页\编于星期五\11点1）TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→5′外切活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。TaqDNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4。2）TaqDNA聚合酶还具有逆转录酶活性,温度一般为65～68℃。(三)低保真性(四)Taq酶的最适温度75~80℃每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为22个核苷酸/秒。最适温度75℃左右。当前第44页\共有108页\编于星期五\11点当前第45页\共有108页\编于星期五\11点（四）原料原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度为20~200µmol/L。Mg2+：为Taq酶的必需激活剂。

浓度为0.5~2.5mmol/L。太少：酶活性明显降低；

太多：导致非特异性扩增。（五）Mg2+当前第46页\共有108页\编于星期五\11点反应温度和时间1.变性：

95℃，30”~1’双链DNA变成单链。2.退火：55℃，30”~1’引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大。退火温度=Tm值-(5～10℃)Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T）3.延伸：72~75℃，1’~2’Taq酶催化dNTP，从引物3’-OH端开始，与模板互补，合成一条新的DNA链。小于20bp片段当前第47页\共有108页\编于星期五\11点反应缓冲液：常用10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.3~8.8为Taq酶最适pH值。循环次数：主要取决于模板DNA的起始浓度，合适的循环数为25~30次。

循环数太少：产物量不多循环数太多：非特异性扩增会增加，出现平台效应当前第48页\共有108页\编于星期五\11点PCR反应体系5×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双蒸水至50ul当前第49页\共有108页\编于星期五\11点四、PCR常见问题1.无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太低延伸时间太短

原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物提高退火温度、延长延伸时间现象：对照组有条带，而样品则无；当前第50页\共有108页\编于星期五\11点2.非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。当前第51页\共有108页\编于星期五\11点引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因对策重新设计引物适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低Mg2+浓度减少循环次数非特异性扩增当前第52页\共有108页\编于星期五\11点3.拖尾

现象：产物在凝胶上呈拖尾状态。M12当前第53页\共有108页\编于星期五\11点模板不纯引物的特异不强降解退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多电泳体系的问题

原因对策纯化模板重新设计引物改变条件适当提高退火温度减少酶量或更换酶适当降低dNTP和Mg2+的浓度观察marker是否也存在拖尾现象

拖尾当前第54页\共有108页\编于星期五\11点4.假阳性原因：靶序列或扩增产物的交叉污染，引物设计不当。

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

当前第55页\共有108页\编于星期五\11点五、PCR实验注意事项由于PCR的灵敏性极高，故微量的样品污染便可导致假阳性结果的出现。所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染采取的措施：1）隔离不同的操作区2）采用一次性用具3）严格按无菌操作原则进行4）并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。当前第56页\共有108页\编于星期五\11点除实验样品外，应设几种实验对照：1）阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR反应；阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本。2）阴性对照：无核酸模板参与的PCR反应；在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。

当前第57页\共有108页\编于星期五\11点示例电泳结果

12345MM：DNAmarker1：为阳性对照2：为阴性对照3-5：为扩增出的DNA条带当前第58页\共有108页\编于星期五\11点DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……六、PCR技术的主要用途PCR当前第59页\共有108页\编于星期五\11点利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段。1.目的基因的克隆当前第60页\共有108页\编于星期五\11点大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因基因工程产品当前第61页\共有108页\编于星期五\11点A’内源性病变基因正常人(+)A病人(-)病原微生物基因正常人(-)病人(+)2.基因检测当前第62页\共有108页\编于星期五\11点遗传病的诊断

基因缺失、插入或置换等地中海贫血珠蛋白链合成障碍，或珠蛋白的组分改变，功能降低当前第63页\共有108页\编于星期五\11点A正常人病人正常病人当前第64页\共有108页\编于星期五\11点ASO探针法病人ACTGASO探针正常PCR-ASO检测基因点突变：利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，再用人工合成的含突变位点标记的寡核苷酸探针杂交直接检测突变点当前第65页\共有108页\编于星期五\11点探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子当前第66页\共有108页\编于星期五\11点PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态体）法：

限制性核酸内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因当前第67页\共有108页\编于星期五\11点突变限制性核酸内切酶当前第68页\共有108页\编于星期五\11点正常突变电泳当前第69页\共有108页\编于星期五\11点3.DNA和RNA的微量分析PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

当前第70页\共有108页\编于星期五\11点PCR后将待测DNA片段既可克隆到特定的载体进行序列测定，也可直接测定。PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性的探针。4.DNA序列测定5.用PCR标记DNA探针当前第71页\共有108页\编于星期五\11点mRNA

第二节常用几种PCR反应1)RNase2)碱性液(水解RNA)

单链DNA逆转录酶

(使dNTP聚合)RNA-DNA杂化链PCR一、逆转录PCRDNA聚合酶双链DNA(使dNTP聚合)PCR当前第72页\共有108页\编于星期五\11点二、实时PCR实时PCR（real-time

polymerase

chain

reaction）又称荧光定量PCR。在PCR反应体系中加入荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

当前第73页\共有108页\编于星期五\11点荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。实时PCR(real-timePCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR，得到广泛应用。荧光定量PCR标记方法：序列特异性探针：如 Taqman内掺式染料：如SYBRGreenI当前第74页\共有108页\编于星期五\11点PCR引物实时PCR技术原理当前第75页\共有108页\编于星期五\11点引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针当前第76页\共有108页\编于星期五\11点报告基团淬灭基团当前第77页\共有108页\编于星期五\11点无荧光信号产生能量激发光完整的探针：5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移）

当前第78页\共有108页\编于星期五\11点变性(95ºC)当前第79页\共有108页\编于星期五\11点退火(60ºC)当前第80页\共有108页\编于星期五\11点退火(60ºC)当前第81页\共有108页\编于星期五\11点当前第82页\共有108页\编于星期五\11点当前第83页\共有108页\编于星期五\11点?当前第84页\共有108页\编于星期五\11点5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来当前第85页\共有108页\编于星期五\11点当前第86页\共有108页\编于星期五\11点当前第87页\共有108页\编于星期五\11点当前第88页\共有108页\编于星期五\11点当前第89页\共有108页\编于星期五\11点当前第90页\共有108页\编于星期五\11点当前第91页\共有108页\编于星期五\11点当前第92页\共有108页\编于星期五\11点当前第93页\共有108页\编于星期五\11点当前第94页\共有108页\编于星期五\11点当前第95页\共有108页\编于星期五\11点实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记分子RQ3'3'5'5'荧光报告分子荧光淬灭分子荧光信号当前第96页\共有108页\编于星期五\11点SYBRGreenI作用机理EmissionEmission当前第97页\共有108页\编于星期五\11点SYBRGreenI作用机理ExcitationEmission当前第98页\共有108页\编于星期五\11点原位PCR(InSituPCR,IS-PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内进行原位扩增目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物进行定性定量定位分析。即把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的一种技术。三、原位PCR当前第99页\共有108页\编于星期五\11点▲待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的