考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量演示文稿

考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量演示文稿当前第1页\共有20页\编于星期五\11点（优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量当前第2页\共有20页\编于星期五\11点【实验原理】

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。当前第3页\共有20页\编于星期五\11点考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。当前第4页\共有20页\编于星期五\11点蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。当前第5页\共有20页\编于星期五\11点考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。当前第6页\共有20页\编于星期五\11点在一定蛋白质浓度范围内(1～1000µg/ml）,蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

当前第7页\共有20页\编于星期五\11点由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。当前第8页\共有20页\编于星期五\11点【器材与试剂】（一）器材1.可见光分光光度计2.刻度移液管3.移液枪（二）试剂1.NaCl（0.15mol/L）2.考马斯亮蓝试剂3.蛋白质标准液（1mg/mL）4.待测蛋白质溶液当前第9页\共有20页\编于星期五\11点试管编号0123456待测标准蛋白溶液（mL）00.020.030.040.050.060.100.15mol/LNaCl（mL）0.100.080.070.060.050.040考马斯亮蓝试剂（mL）5555555摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm0？？？？？？当前第10页\共有20页\编于星期五\11点1.如黑板上表格操作2.绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。3.算出待测蛋白质浓度？当前第11页\共有20页\编于星期五\11点【分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法】定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。特点:灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。

当前第12页\共有20页\编于星期五\11点分光光度计的分类

红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区

测定波长范围为400~760nm的可见光区测定波长范围为200～400nm的紫外光区当前第13页\共有20页\编于星期五\11点可见光谱可见光范围内波长和颜色的关系当前第14页\共有20页\编于星期五\11点分光光度计的基本结构

无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:

入射光强度Io透射光强度I样品池

检测器及仪表单色器光源当前第15页\共有20页\编于星期五\11点光照射到物质上，物质的分子结构决定哪些特定波长的光被吸收。这一现象符合符合朗伯－比耳定律。入射光强度Io样品浓度c光程b透射光强度I当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)当前第16页\共有20页\编于星期五\11点朗伯—比尔定律:

A=lg(1/T)=Kbc

A为吸光度;T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0);c为吸光物质的浓度;b为吸收层厚度(光程）.

物理意义当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及