荧光定量实验技术

荧光定量实验技术第一页，共五十一页，编辑于2023年，星期二内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程荧光定量PCR仪生工荧光定量产品选择指南2第二页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测3第三页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－标记方法4SYBRGreenI4TaqManProbe分子信标第四页，共五十一页，编辑于2023年，星期二SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI5SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI5第五页，共五十一页，编辑于2023年，星期二SYBRGreenI染料法－－作用机理66第六页，共五十一页，编辑于2023年，星期二SYBRGreenI染料法－－融解曲线7将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱7第七页，共五十一页，编辑于2023年，星期二SYBRGreenI染料法－－融解曲线8融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：定量不准确8第八页，共五十一页，编辑于2023年，星期二Taqman探针法－－原理95′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，MGB为不发光的荧光基团探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针，R与Q分开，发荧光。

9第九页，共五十一页，编辑于2023年，星期二Taqman探针法－－工作机理10热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR10第十页，共五十一页，编辑于2023年，星期二Taqman探针法－－PCR体系的建立引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp,引物Tm为59-60℃反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM其他与常规PCR相同1111第十一页，共五十一页，编辑于2023年，星期二实时荧光定量PCR分类－－分子信标12标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂12第十二页，共五十一页，编辑于2023年，星期二实时荧光定量PCR分类－－分子信标13FRET13第十三页，共五十一页，编辑于2023年，星期二几种荧光定量PCR方法的应用比较14方法优点缺点适用范围SYBRGreenI适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断分子信标高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析14第十四页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值1515第十五页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－扩增曲线16Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件16第十六页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－荧光阈值17Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold17第十七页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值18Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Ctvalue18第十八页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性19横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性19第十九页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理20理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数20第二十页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理21非理想的PCR反应Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0

：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率21第二十一页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理22在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0*（1＋En）Ct＝M

（1）整理方程式（2）：方程式（1）两边同取对数得：XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为MLog2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct

（2）Log2X0

=Log

2M

-CtLog2（1＋En）22第二十二页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系23CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。23第二十三页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认24线性关系、扩增效率确认相关系数（R2）：大于0.98标准曲线斜率：-3－-3.5PCR扩增效率（E）：0.9-1.2检测灵敏度确认35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增Notemplatecontrol确认35Cycles内无引物二聚体产生24第二十四页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR技术的主要应用定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等2525第二十五页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量PCR的解析方法绝对定量解析方法相对定量解析方法2626第二十六页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量的定义27Sample25Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量27第二十七页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量分析几要素28一个目的基因

——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本

——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreenI法或Taqman探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。28第二十八页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量质粒标准品的制备29PCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用29第二十九页，共五十一页，编辑于2023年，星期二质粒标准品稀释方法30倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v30第三十页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量31方法：检测毕赤酵母的A基因标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取ADNA；

设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。31第三十一页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量32Samplecopies/mlCt1Ct3Ct2MeanCtSTD标准品1.41×10522.3322.2022.4622.330.13标准品1.41×10618.7018.3218.6118.540.20标准品1.41×10715.0915.1515.3715.200.19标准品1.41×10811.7811.9811.6211.790.18标准品1.41×1098.308.358.268.300.046未知样品?18.4418.4718.4418.450.024空白对照NoneNone32第三十二页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量33扩增效率（E）计算

E=10-1/斜率

-1=10-1/-3.481

-1

=1.983-1=0.938标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.481x+40.123R2=0.9996

相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。33第三十三页，共五十一页，编辑于2023年，星期二绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量34未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226

=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.22634第三十四页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量的必要性35SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析35第三十五页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析方法36比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！36第三十六页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析几要素37一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）一组标准样本（有些分析方法不需要）37第三十七页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－管家基因筛选38管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O38第三十八页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－两种常用的分析方法39双标准曲线法2-△△Ct法39第三十九页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－双标曲线法40通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。公式：相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值40第四十页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－双标曲线法41优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一检测样品目的基因A管家基因H定量结果定量结果校正值相对量对照样品123456780.2171.000待测样品1112455780.2010.926待测样品2108957890.1880.866实验数据41第四十一页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－2－△△Ct法42假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或最后用任一待测样本q的XN

除以对照样本（calibrator，cb）的XN

得到：

对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：XT是目标基因达到设定的阈值时的分子数RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数42第四十二页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－2－△△Ct法43公式：F=2－优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；实验条件优化较为复杂。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

待测组目的基因平均Ct值待测组内参基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组内参基因平均Ct值－－－43第四十三页，共五十一页，编辑于2023年，星期二相对定量分析－－2－△△Ct法44实验数据：2-△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%

△Ct（处理前）＝15－13＝2△Ct（处理后）＝18－20=－2

△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－2－2＝－4比率（处理后/处理前）＝2－△△Ct＝2－（－4）＝16所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的16倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正为：E－△△Ct，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为1.95－△△CtSampleJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E处理前15131.95处理后18201.9544第四十四页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项45样品制备定量体系配备引物设计反应条件优化浓度确定技能要求环境要求误差控制数据分析仪器介绍RT上机反应体系优化试剂选择分析方法45第四十五页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项46样品制备环境要求定量体系配备数据分析RT上机浓度确定无RNase环境使用无RNase耗材专用RNase-free工具纯度高、完整性好的RNA分光光度计检测电泳检测46第四十六页，共五十一页，编辑于2023年，星期二荧光定量(SYBRGreen)实验流程及注意事项47样品制备试剂选择定量体系配备数据分析RT上机反应体系优化AMVM-MLV高效，全长的cDNA下游反应数确定反转录体积引物的