广西地方标准常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术规范第3部分疾病防治用药药效检验（征求）

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB52FORMTEXTDBFORMTEXT45DBFORMTEXT45/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2021FORMTEXT常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术标准第3局部：疾病防治用药药效检验FORMTEXTThetechnicalregulationsofcommonfreshwaterfarmedfishdiseasediagnosisandtreatment－part3drugefficacytestfordiseasecontrolFORMDROPDOWNFORMTEXT2021-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXT2021-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT广西壮族自治区质量技术监督局发布目次TOC\h\z\t"前言、引言标题,1,参考文献、索引标题,1,章标题,1,参考文献,1,附录标识,1,一级条标题,3,二级条标题,4"前言 IV1范围 12标准性引用文件 13试剂和材料 13.1试剂 1无菌生理盐水 1预溶剂 1稀释剂 13.2材料 2培养基 2菌株 2病鱼样品 2病幼样品 2养殖池水 2药物 24仪器设备与器具 24.1仪器设备 24.2器具 25抗生素药效检验 25.1培养基制备 2肉汤培养基 2营养琼脂平板 25.2百倍母液制备 3试剂除菌 3储存液制备 3储存液定容 3百倍母液稀释 35.3MIC范围筛选 35.3.1梯度药液配备 3菌悬液制备 3菌液接种 3孵育 3结果观察 45.4MIC测定 45.5抑菌圈测定 4菌板制备 4药液配置 4药敏试验 45.5.4抑菌圈测量 45.6判定 46消毒剂药效检验 46.1药物称量 46.2母液制备 46.3检验 5养殖用水消毒 5细菌培养 56.4结果观察 56.5判定 57杀虫驱虫药药效检验 57.1外用杀虫药 5药物称量 5母液制备 5母液稀释 5检验 5判定 57.2内服驱虫药 5病鱼样品暂养 5药物称量 6母液制备 6药饵制作 6药饵投喂 6判定 68水质改进剂药效检验 68.1药物称量 68.2母液制备 68.3母液稀释 68.4判定 69免疫增强剂药效检验 69.1病龟样品暂养 69.2药物称量 79.3母液制备 79.4药饵制作 79.5药饵投喂 79.6结果观察 79.7判定 710记录 7前言DB45/T1087?常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术标准?分为三个局部︰——第1局部︰资料记录、病因与病损度诊断及应对措施；——第2局部︰疾病诊断与防治；——第3局部︰疾病防治用药药效检验。本局部为DB45/T1087的第3局部。本标准按照GB/T1.1－2021给出的规那么起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准起草单位︰广西壮族自治区水产技术推广总站、广西大学。本标准起草人︰胡大胜、龙光华、黄钧、韩书煜、黄艳华、梁静真。常见淡水养殖鱼类疾病诊治技术标准第3局部：疾病防治用药药效检验范围本标准规定了常见淡水养殖鱼类疾病防治用药药效检验的试剂与材料、仪器设备与器具、抗生素药效检验、消毒剂药效检验、杀虫驱虫药药效检验、水质改进剂药效检验、免疫增强剂药效检验与记录。本标准适用于广西境内常见淡水养殖鱼类疾病的诊断与防治。标准性引用文件以下文件对于本文件的应用是必不可少的。但凡注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。但凡不注日期的引用文件，其最新版本〔包括所有的修改单〕适用于本文件。GB/T27623.1-2021渔用抗菌药物药效试验技术标准第1局部：常量肉汤稀释法药物敏感性试验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法试剂和材料试剂无菌生理盐水精确称取8.50g分析纯氯化钠，参加1L蒸馏水溶解后加热至121℃高压灭菌15min。预溶剂0.1M二甲基甲酰胺溶液，0.1N氢氧化钠溶液，乙醇。各种药物的预溶剂见表1。各种抗生素的预溶剂药物名称预溶剂药物名称预溶剂磺胺甲噁唑0.1N氢氧化钠硫酸新霉素蒸馏水氟苯尼考0.1M二甲基甲酰胺盐酸多西环素蒸馏水甲砜霉素0.1M二甲基甲酰胺乳酸诺氟沙星蒸馏水磺胺二甲嘧啶热乙醇烟酸诺氟沙星蒸馏水磺胺嘧啶钠蒸馏水稀释剂蒸馏水，质量符合GB/T6682要求。

材料培养基营养琼脂培养基，肉汤培养基。菌株嗜水气单胞菌标准菌株或确定耐药性消除的革兰氏阴性病原菌。病鱼样品确诊感染寄生虫或水霉的鱼种，数量≥30尾，用于杀虫驱虫药药效检验。病幼样品精神萎靡不振、两眼暗淡无神、活动缓慢的幼龟，数量≥30只，用于免疫增强剂药效检验。养殖池水氨氮含量＞1mg/L的养殖池水200L，用于水质改进剂药效检验。药物质控药物：盐酸多西环素，含量98.5%。待检药物：抗生素、消毒剂、杀虫驱虫药、水质改进剂和免疫增强剂。仪器设备与器具仪器设备生化培养箱，无菌操作台，生物显微镜，高压灭菌锅，精确度为0.1mg的分析天平，麦氏比色管。器具20μL～200μL、100μL～1000μL和1000μL～5000μL移液器，30L、50L和250L塑料容器，枪头，刻度吸管，洗耳球，药勺，1L容量瓶，500mL三角烧杯，玻璃棒，涂棒，培养皿，接种环，酒精灯，牛津杯，气泵。抗生素药效检验培养基制备肉汤培养基用干粉培养基制备成普通肉汤培养基，12l.3℃高压灭菌20min后，4℃保存备用。营养琼脂平板用干粉培养基制备成普通营养琼脂平板，12l.3℃高压灭菌20min后，4℃保存备用。

百倍母液制备试剂除菌预溶剂用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，稀释剂高压灭菌除菌。储存液制备药物称量用精确度0.1mg分析天平精确称量含有效成分1000mg的药物，置于1L烧杯中。某厂家生产的某品牌含量10%氟苯尼考，称量时，准确称取10g，置于1L烧杯中。药物预溶按称量药物重量的3倍加预溶剂到烧杯中，充分搅拌溶解。储存液定容向参加容量瓶参加蒸馏水稀释，最后定容1000mL，过滤冷藏可储存7d。百倍母液稀释另取一个500mL烧杯，参加100mL蒸馏水，用移液器精确吸出10mL蒸馏水，再用移液器精确吸取定容储存液10mL参加烧杯充分混匀。MIC范围筛选梯度药液配备参照GBT27623.1执行。取10支试管，第1管参加10mL普通肉汤培养基，第2～10管分别参加4mL普通肉汤培养基。第1管吸出2mL培养基，参加2mL百倍母液混匀，吸出2mL弃掉，吸4mL参加第2管混匀，再吸4mL参加第3管混匀，以此类推到第8管；第8管混匀后吸出4mL弃掉，配置成20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.312μg/mL和0.156μg/mL8个梯度药液。第9管和第10管不加药物，第9管作细菌生长对照，第10管作无菌控制对照。配置磺胺类药物的梯度浓度时，第1管吸出5.12mL培养基，参加5.12mL储存液混匀，吸出2mL弃掉，吸4mL参加第2管混匀，再吸4mL参加第3管混匀，以此类推到第8管；第8管混匀后吸出4mL弃掉，配置成512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL和4μg/mL8个梯度药液。菌悬液制备取经配套营养琼脂平板新鲜培养的待检菌株，用0.85%无菌生理盐水洗到已灭菌的试管中，加0.85%无菌生理盐水至菌液浓度为0.5×108CFU/mL。菌液浓度用麦氏比色管校正。菌液接种菌液制备好后，应在≤15min参加第1～9管试管中，第10管不加。菌液接种后的最终浓度为5×105CFU/mL。菌液浓度用麦氏比色管校正。孵育菌液接种后，于28℃生化培养箱孵育24h。结果观察取出试管观察：试管中液体澄清为无菌生长、半浑浊为少量菌生长、浑浊为大量菌生长，细菌生长对照管浑浊、无菌控制对照管澄清。记录试管中液体澄清的最小药液浓度和半浑浊的药液浓度。MIC测定根据最小药液浓度和半浑浊的药液浓度配置梯度药液，按照5.3操作重做试验，读取并记录最小抑菌浓度〔MIC〕。质控药物的MIC在0.5μg/mL~2μg/mL范围内，试验有效。抑菌圈测定菌板制备取上述菌悬液100μL，注入营养琼脂平板中，用三角涂棒将菌悬液均匀涂抹于营养琼脂平板上。药液配置按照MIC的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20倍浓度分别配置药液。药敏试验无菌条件下，将经酒精灯火焰烧热一端的牛津杯放置在涂抹了菌悬液的营养琼脂平板上，间距3cm，每个培养基平板放置5个。将配置好的各种浓度药液参加牛津杯杯体中，药液加至满而不溢为止。将营养琼脂平板置37℃生化培养箱中培养24h。抑菌圈测量取出营养琼脂平板，测量记录抑菌圈直径，并按照美国临床实验室标准化委员会〔NCCLS〕最新版的药敏试验标准判断各种浓度药液是否敏感。判定抑菌圈测定敏感的最小药物浓度＜说明书的用药浓度，判定该抗生素有效。消毒剂药效检验药物称量按药物使用说明书用量的1000倍，用精确度为0.1mg的分析天平精确称量药物，置于1L容量瓶中。某厂家生产的某品牌含量8%二氧化氯，说明书治疗用量为每667m3水体用100g～150g。取最大用量150g，用药浓度为0.2249mg/L。称量时，准确称取224.9mg二氧化氯，置于1000mL容量瓶中。母液制备向容量瓶参加蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1000mL。

检验养殖用水消毒取30L塑料容器参加20L养殖用水，然后沉着器中准确取出20mL水再加20mL母液，混匀静置消毒2h。细菌培养分别取养殖用水和消毒2h后水体各100μL，在无菌条件下，分别涂布于无菌平板上，28℃培养24h。结果观察培养24h后，取出平板观察菌落生长情况。判定涂布养殖用水平板长菌，涂布消毒2h后水体平板不长菌，判定该消毒剂有效。杀虫驱虫药药效检验外用杀虫药药物称量按药物使用说明书用量的1000倍，用精确度为0.1mg的分析天平精确称量药物，置于1L容量瓶中。如1包200g的杀虫药可用于8亩1m水深池塘，即每667m3水体用25g，用药浓度为0.0375mg/L。称量时，准确称取37.5mg杀虫药，置于1000mL容量瓶中。母液制备向参加容量瓶参加蒸馏水溶解、稀释，充分搅匀，最后定容1000mL。母液稀释取50L塑料容器4个，分别参加40L水，然后分别沉着器中准确移出40mL水再加40mL母液，充分搅匀。再取50L塑料容器1个，参加40L水，作为对照。检验向4个容器分别放6尾～8尾确诊感染寄生虫的鱼种入稀释母液的容器，30min后用生物显微镜逐一检查鱼体表或鳃上寄生虫的脱落或死亡情况。判定2h内，检验组鱼体表或鳃上寄生虫大局部脱落或死亡，对照组鱼体表或鳃上寄生虫没有脱落，判定该杀虫药有效。内服驱虫药病鱼样品暂养取250L塑料容器4个，3个为检验组，1个为对照组；分别参加养殖用水150L，各放养确诊感染体内寄生虫的鱼种7尾～8尾，不间断充气增氧，投喂饲料1次/d，吸污1次/d。鱼种放养前称量总重。

药物称量根据暂养鱼种总重和药物使用说明书，计算出鱼种用药总量，