《分子生物学检验技术》实验指导

实验一小鼠肝组织DNA的提取及鉴定【实验目的】掌握动物组织DNA提取的方法；掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括BufferCL、BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK御（7揉）揉生理随盐水干，建4℃逃贮存黄（8相）曾无水惰乙醇步、7授0%蜡乙醇瑞【匠操作滔步骤导】孟1、饭制备赵肝匀除浆舞迅速零处死然小白畜鼠，蝴称取握新鲜菊肝脏居组织微50芒m闷g俯，用妖预窝冷聪生理砌盐水绍洗去催血液州，滤认纸吸情干后浩剪碎织组织命，甘将剪宴碎组傻织放榴于组析织匀拢浆器纽或研适钵中召研翅磨榆，同呜时加旁入3肃00序测μl叮B票uf舰fe废r砌CL横。太将肝圣匀浆哲液祥放入滚EP湖管，雀加入物1.迷5雁μl动蛋白临酶K巧，歼漩涡鸡震荡搅10扣s饶，美55梁℃盐孵育茄直到踏组织差溶解协（约柜1小您时）催。疯2、运提取告DN熔A姓（1污）进加入香1.闷5夫μl改R次Na螺se饲A转，颠扎倒混蕉匀，薪37膝℃号孵育锣15图-6芹0悄mi茂n株。喉（2程）脱冰上耕孵育怒1分弦钟使常样品皮迅速块冷却摘。诚（3迁）茄加入亏1/骑3体海积的滩Bu顽ff粉er涨P泰P，陕涡旋课震荡哄20歌s份，1戏20率00慢r称pm完离心在3骗mi牧n赠。绪（4娘）弃将上状清转俘移到搞—移个新梦的离中心管嘴中，什加入休等体猾积异耀丙醇静，轻趋轻颠夹倒混据匀架，可挎见絮独状沉云淀（口纤维密状D码NA泊）从及溶液分中析死出木。1使20护00夹r县pm郑离心类1栋mi宰n，召弃上经清。苹（5是）正加入叠30竹0英μ挡l燥70净％乙闭醇，糖颠倒视数次沫以洗值涤D著NA养沉淀陕。1蛾20邀00畜r纳pm颤离心千1纲mi重n，架弃上晒清，疯室温恼干燥火15垫m林in陷。济（6助）加样入5郑0希μ北l退Bu流ff伴er旺G我E溶昆解D引NA套（如寄果D平NA衡的量族比较风大，欲可以磨65切℃嫂孵育苦以促挎进D驳NA吵的溶党解）恋，尼室温它保存愤待测伴。稳3、紫DN趋A浓睛度和锅纯度今的测请定理取责0.俩1罢ml淹D升NA仍样品朵，欠加雕蒸馏隙水惨至1框m嫁l删，在置75玩1紫湿外分冰光光轿度计备上测近A话26帆0在值和禾A德28忍0挠值。跨计算筑：需DN扛A浓把度（夹μg鱼/m浪l）膊=宿A块26弱0授×5判0×两10召（坑请问行系数忽50惕、1刚0蛮是如冶何得扶来的感？助）陡DN颜A纯够度屿=格A汁26消0n首m奇/A锻28身0n岔m奖【施注意象事项骨】风（1贝）由疏于D染NA号主要预存在壁于细协胞核爪内，亦为便税于提摄取D具NA司，肝痰脏的植破碎司要严术格控池制好翅。即智要尽臭可能碗的将鼻细胞挡膜破羽碎，每又要凳尽可染能多戚保留在完整咸的细营胞核艇，以残保留骨60锤～7槽0％点的完忧整细淘胞核飞为宜宣。为锻避免窜DN通A过燥度断答裂，季不宜钞用电堪动研清磨器痒制备烂匀浆宗。班在提除取过轻程中尊，染仅色体威会发蔽生机窑械断走裂，捏产生焰大小叮不同嫁的片动段，荷因此黎分离炉基因浴组D瞒NA烧时应窝尽量轻在温国和的逐条件鸟下操窜作，废如尽半量减乔少酚远/氯酿仿抽尺提，摘混匀村过程确要轻怠缓,限以橡保证扑得到氧较长犹的D滋NA顾。妻（2报）用焰氯仿拉除去调组织篮蛋白牵，要诱不断治振荡流使蛋息白质瓣变性芒。械如要挡得到深高纯梦度D掀NA损，可蛮加入颗蛋白扬酶K吉降解满蛋白倡质。响（3炸）酚湿和氯惧仿均坊有很溜强的赌腐蚀耳性，含操作喊时应熄避免兴接触单皮肤蹲。再（4慈）室旅温下障干燥点时尽渡可能顺使残奶留的极乙醇劈挥发英掉（未DN矮A中舒残留鄙的乙搂醇会却影响腥内切表酶的虹活性塑或电婆泳时肤DN承A不僚下沉董），粮但不扑要让评DN塑A完捡全干干燥，闲否则脏极难销溶解宋，D隆NA生溶解遣过程周通常茅需要拒12奏-2口4h百r。漆（5推）提管取过大程应苍尽量地保持藏低温舟。可（6有）鼻在波派长2政60跟nm边紫外渐线下卧，1射OD柄的光趁密度询值相同当于思双链悦DN介A浓哗度为维50站μg喇/m扁l；软单链息DN勉A或有RN稠A为宅40疏μg坑/m宰l；军单链秒寡核猎苷酸债为2钥0μ辜g/丰ml纳。据办此来捕计算闭核酸请样品峰的浓调度。抢紫外深分光缴光度衬法只擦用于禁测定蹈浓度右>0摇.2现5μ掘g/倍ml略的核娇酸溶惕液。睬（7仔）愈A宜26业0n陕m傻/A淋28悄0n弱m抵比值袖应介律于1届.8蛋~2鸭.0捎之间谈，若定比值烧>2多表示阅DN长A样轮品中麻含有蜻较多瓜的R先NA内，如婶比值灶<1同.8病表明饮样品晌中有扩蛋白锁质污垒染。秩应根荷据后池续实固验要抖求，知采取波不同孔的方销法纯分化。吹当然亲也会炎出现乓DN错A溶况液中抚既含哑蛋白攻质又检含R赠NA菌，其口比值灭介于闪1.错8~仁2.康0的悉情况驳，所览以有川必要考结合默凝胶就电泳诊等方僚法鉴肺定有丝无R利NA介，或略用测称定蛋务白质芳的方成法检唐测是抱否存锤在蛋帜白质校。痕【离结果端】壶1、坡A书26拦0锯=震，A匆28罚0阅=鄙。薪2、搜小鼠亦肝组钓织中驰DN瞧A浓骡度是伪μg津/m并l。孕3、管小鼠遇肝组排织中亿DN连A的煮A撞26柿0n表m属/A被28役0n穷m主比值敌是腊。倍【临思考宴题】艰提取百和纯你化的非真核绒组织申DN奋A有伯何用画途？队你的同A骂26炼0n凳m销/A彼28恩0n个m手比值汽结果道是否农介于窃1.伶8~墙2.谁0之伙间？械有何彩意义推？卧请结北合你业的实抖验结期果毁和操崇作步炉骤蔑，分麻析如乡何返检测绝和狸保证岁DN蛇A的眼质量们？普实验蜻二乳聚合济酶链援反应涌【茂实验档目的问】休就执采用幸聚合锤酶蔑链式柱反应阀技术颤扩增顷小鼠见肝门组织藏平滑丰肌收套缩季蛋白霞（葵SM艇22笑α迎）基膛因累【忙实验碰原理象】词聚合斑酶链尘式反侨应好（盟po柄ly响me杜ra候se史c搁ha迈in眯r方ea荒ct心io曾n，义PC卸R陡）倾用于崖体外何扩增昨位于缩两段欠已知围序列窄之间货的D蜂NA障区段感（舅靶序星列村）级。其交原理雀是通磁过耐须热D遇NA斤聚合月酶催层化的磁DN草A合薪成反孙应达京到对目靶序蚊列的扯扩增失。反达应中裁使用躁两条妻化学姨合成滩的寡掌核苷箱酸作应为引饭物，调分别受与模菊板D夏NA难两条吩单链疏互补列，待驼扩增苍序列热片段据位于狐两条跃引物圆之问车。隙PC谢R扩麦增包蜜括3浙个步诱骤，忧即变垒性、虹退火则和延响伸乌。表反应夺需要吃模板号、峡引物经、敢DN群A聚蕉合酶灵和筋脱氧炎核糖析三磷馅酸(屿dN待TP粉)秘等的锹参与蚂。反净应混龄合液气被加蜜热以爪使模斑板D患NA承双链沉变性剖成为愈二条选单链涂，随问后将碌反应档混合凑液冷志却至忌引物责的熔忙点温大度(溪Tm毁)以棕下，吼使引啦物能呢与靶薄序列恭形成她杂交垂双链旁（达退火杨）米。当偶温度置升至妙72厨℃惧左右骡时，璃反应缘体系灯中的晃DN润A聚币合酶他按照考模板由链的隔序列激以碱匪基互债补方逢式依订次把隆dN艇TP到加至孩引物树的3刮’防端，香使互灭补链斥从5纲报‘黎向3眼’答方向节不断灶延伸矮，直黑至形准成新踏的D羞NA钱双链晌。通估过变舒性、刺退火葛和延营伸的赵一个盗循环拼可以柿使靶虫序列弦的分梦子拷佩贝数丙增加饿一倍渗。由神于每锈次扩普增的形产物私又作迟为下聚一次厚扩增蒙的模宣板，承因此陈反应玉产物仔的量妈以指问数形奖式增悉长，息一个丛分子母的模渔板经迟过n福个循尾环可顽得2送n暗个分合子拷通贝产造物。召本实螺验扩北增的互是小提鼠绳肝阴组织惜平滑慧肌收宁缩狐蛋白赚（厕SM维22液α华）基险因绒，扩面增产咳物片机段大追小为迷54格1昏bp财。扩苦增所潜用的城上游丽引物销序列忘为：币5择’皱-森AG闪TT您AT贤AT必TA啄AT希TT局TG拐CA趟TA矛GT包GC淹CT色GG雁TT交G早-3体’禽，下斥游引深物序插列为齐：5寇’托-督GC群GC已TA呀GC孤TA枪CA片AG拾GC逃TT颗GG槽TC凑GT晨TT盘G忍-3抖’听。翠【杰实验默器材朝和试琴剂】弄1、斩设备菌PC宏R仪辅、0腾.2丝ml戴P龄CR水反应慢管、会1.掌5m旅l离志心管成、移践液器掌、吸咏嘴、脚旋涡疏混合怕器。贩2周、恼试剂胞（2易0炭μ匪l体喜系）匹PC阳R试顺剂盒轮（北恼京康筛为世氧纪生坑物科钩技公常司）器【乘操作团步骤纸】叶分别吐在P周CR献反应弊管中钞加入帝2×贷P耳CR怠m捉ix迁1疫0搁μ泡l、告上游摄和下刮游引岩物各强2珍μ涨l、涝DN脊A央2窄μ葱l和吴H槽2达O概4蹄μ幼l。陕把P存CR咏反应污管放训人P钟CR画仪，呈按仪泪器操范作要掀求启他动扩些增程叉序。京本实潮验的眠扩增辫程序惨为：蚁94汤℃你预变袖性5品分钟跳后进摄入循庙环扩凉增，热即9逃4男℃护变性断30穷s，售58故℃凡退火努30卷s，箭72南℃惰延伸族1心mi庆n。童重复匠35追个循兰环后乒，于蝴72桐℃炎再延仆伸1格0团mi速n，供最后香4勉℃荐保温最。辅反应办结束化后，啄将P怖CR坛反应默管于涛12星00兔0救rp飘m离闲心1让5s威，取莫扩增茶产物析进行充电泳层分析穷。暮【恢注意烦事项赛】蚁1梦、系由于凯PC础R技豪术的蜜灵敏瞧度高毕，极去微量誓的污遮染也胁会造吃成扩消增的载假阳齐性结韵果。滋因此浇，必刑须采勒取相渠应措缠施避局免发枝生污冬染。谜2疾、鹊PC挨R实你验应恰设立阶阴性延对照旷反应肾，即详在反部应体浙系中些不加鸽模板龙DN押A。最3杜、箩多份逆样品穿同时辽扩增查时，蛙可配坛制总勿的反留应混熔合液淹，并舟分装醒于P孩CR胞管中睡，然雁后再共在各消管中绒分别绩加入凉模板喇。秆4叠、鄙临床遥诊断光用P胳CR雨反应平必须尚在专胖门的斑PC总R实犁验室含中进扰行，迷实验闸室应董包括乌试剂缸配制珠室、壳模板泉制备污室、挖PC仪R扩尖增室蚂和产旗物检播测室袍等功磁能区辣。P桨CR盏实验渡中的良各个由步骤沿应在蛾相应炮的功梨能区搁中进光行。胳5装、仁PC吗R试屋剂与剖模板铃DN棍A及渡样品肤应分刊别保壮存于狮不同有功能宋区的孕冰箱籍中。急6赌、忌操作稳时应赌戴手碎套，乔配制淹反应嗓体系矮和加吗模板肯时应遥分别瓶使用颈专用侧的移顽液器填，所殊有耗奉材使勇用前播必须贸经高列压灭蒙菌，殊用后乓按规迁定处泄理并磁丢弃君在指躬定容越器中掉。灶【讨结果麦】蛇【帅思考术题】补PC芹R各傻组分睬在反算应中青的作榴用是赠什么夺？窄降低片退火学温度冒、延定长变辉性时擦间正会袜对反恶应有桶何影月响？绍实验累三滑端琼脂雄糖凝完胶电霸泳纱【实麦验目到的】奖掌握臂琼脂凡糖凝壳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