新冠状病毒实验室检测课件

人冠状病毒病原学与实验室检测冠状病毒（coronavirus)概述：1933年，Baudette等描述了鸡的“哮喘病”，1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒，分离的病毒被鉴定为传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis,IBV);1951年，Gledhill等分离出鼠肝炎病毒(Murinehepatitisvirus,MHV)；1965年，Tyrrell和Bynoe首次在体外用人胎鼻和气管培养方法，从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。1966年，Hamre和Procknow用人胚肾细胞分离到类似病毒，代表株命名为229E病毒。

1967年，Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43（OC代表organculture）。随后证明，OC和229E病毒。1968年，JuneAlmeida和Tyrrell对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年，国际病毒命名委员会（InternationalCommitteeontheTaxonomyofViruses,ICTV）正式命名了冠状病毒科（coronaviride)致病性：人冠状病毒常引起1)普通感冒、是轻型感染。2)腹泻或胃肠炎。3）下呼吸道感染或肺炎X1X2X3X4X5NME20,00130,0000.51.01.52.02.53.04.05.06.09.025,000SRNA6123kBRNA5RNA4RNA3RNA28.3kb4.5kb3.4kb2.5kb1.7kbSORF1bORF1aNMEABC15,00010,00015,00020,00025,00030,000HCoV基因组与mRNAHCoVs为最大单股正链RNA病毒，独特的胞浆内非连续性转录模式，易于发生基因组的变异与重组SARS-CoV中国大陆全中国全世界发病5327发病7429发病8096死亡349死亡685死亡774涉及世界29个国家和地区2002年冬－2003年春始发于我国广东，而后蔓延至我国大部分省市，并波及世界29个国家和地区。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，严重急性呼吸综合症是由一种从未引起人类疾病的新型冠状病毒所致，这种新的病毒被命名为SARS-Coronavirus(SARS-CoV)SARS

(severeacuterespiratorysyndrome)严重急性呼吸综合征－21世纪新出现的传染病

在SARS-CoV发现后，又有三种新的引起呼吸系统疾病的HCoV（HCoV-NL63，HCoV-HKU1与HCoV-2012）被相继发现，引起人类呼吸道疾病的HCoV

（包括SARS-CoV）已有6种，急需研发这类疾病诊断和鉴别诊断的新技术。继SARS-CoV后,新HCoV病原的发现HCoV-2012冠状病毒NL63

vanderHoeketal.,2004.Nat.Med.10:368-373最初从一名七月龄的，因发烧、细支气管炎和结膜炎入院的患儿中分离。在Hela和TMK细胞中检测到细胞毒效应CPE。随机扩增，分离出特异性片段，经测序证明是一种新的呼吸道病毒。NL63的特异性RT-PCR检测儿童的NPA为阳性。回顾性的分析从2002年12月到2003年2月中测序的呼吸道样本中，有7例阳性标本。其中五个患儿是4-6月龄，两个患者,分别是40岁和67岁。冠状病毒HKU1

Wooetal.,2005.J.Virol.79:884-895从一名71岁的患有肺炎的老人中分离出来。该患者吸烟，并患有慢性阻塞性肺病。临床症状：发烧，咳嗽，脓性痰，胸肺X光片显示有斑点浸润。常规病毒学检测呈阴性。RT-PCR确定是一种新的冠状病毒。回顾性筛选400份NPA样本，有一例是阳性，患者是一名35岁的妇女，患有肺炎。定量RT-PCR：1.1x106copies/mL北京儿童医院重症下呼吸道·感染·婴幼儿呼吸道病毒的检测2008-2010年，采集住院病人鼻咽拭子370份，应用xTAG®

RVPPanel试剂盒进行多种呼吸道病毒检测。样品检出阳性率：96.22%检测结果表明，感染率较高的病毒分别为：Piconavirus：54.05%RSVB：46.49%Bocavirus：33.78%PIV3:15.41%Adenovirus：12.97%HMPV：8.65%IFVA：7.03%HCoVs：6.76%xTAG®RespiratoryViralPanelVersion1(RVP呼吸道病毒检测试剂盒)产品基于Luminex开放式结构平台，将xTAG®技术与xMAP®技术有效融为一体，可快速准确检测多种呼吸道病毒。已或美国FDA批准临床应用发热呼吸道症候群病原谱构成及其流行规律病原谱年龄分布发热呼吸道症候群病毒病原原谱的时间趋势2012中东出现的新型冠状病毒近日，一名曾前往沙特旅游的卡塔尔男子被确认感染了一种新型冠状病毒，也一度被媒体称为类似SARS病毒。目前这名男子正在英国接受治疗，生命垂危。其肺部组织提取的病毒与此前沙特曾出现的一个死亡病例相比，基因排序相似度为99.5%。两人的临床表现都是急性重症呼吸道感染合并急性肾衰竭。目前在全球只确认了这两个病例。还没有证据表明该病毒能够在人与人之间进行传播。新的冠状病毒和引起非典(严重急性呼吸系统综合征)的冠状病毒不同。Fig.Phylogeneticanalysisbasedon1ageneofcoronavirusesandthenewnovelcoronavirus基于已知序列的系统发生分析213London1与Bat-CoV-HKU5序列比对比对结果显示，London1与HKU5的相似性83.2%London1与Bat-CoV-HKU4序列比对比对结果显示，London1与HKU4的相似性82.7%Examplesofbatsandbirdsfromwhichnovelcoronaviruseswerediscovered.Chinesehorseshoebat(Rhinolophussinicus)(panelA),fromwhichbat-SARS-CoVandbat-CoVHKU2werediscovered;Lesserbamboobat(Tylonycterispachypus)(panelB),fromwhichbat-CoVHKU4wasdiscovered;Leschenault’srousette(Rousettuslechenaulti)(panelC),fromwhichbat-CoVHKU9wasdiscovered;AmodelofcoronavirusevolutionCoVsinbatsarethehypothesizedgenepoolofgroup1andgroup2CoVsandCoVsinbirdsarethehypothesizedgenepoolofgroup3CoVs.急性呼吸道感染诊断临床诊断非特异性实验室检测X-光检测特异性实验室检测呼吸道及血清样本用来:抗原检测病毒分离核酸扩增病毒分离:金标准抗原检测:迅速，敏感血清学抗体检测：IgM检测;IgG检测:需要两个样本中和试验核酸检测：

快速敏感病毒诊断学

潜伏期

1-12

天,平均5-6

天,潜伏期内无传染性,发病即有传染性

若将一个传染周期定在5-6

天(平均潜伏期),发病5

天内能确诊病人,则可能将疫情有效控制在2

代病人以内实验室检测在SARS诊断中的重要作用BSL-3

1．SARS诊断分类与标准（1）疑似病例：对于缺乏明确流行病学依据，但具备其它SARS支持证据者，如临床表现和肺X线变化等，可以作为疑似病例，需进一步进行流行病学追访，并安排病原及血清学检查以求印证。对于有流行病学依据，有临床症状，但尚无肺部X线影像学变化者，也应作为疑似病例。（2）临床诊断病例：对于有SARS流行病学依据、相应临床表现和肺部X线影像改变，并能排除其他疾病诊断者，可以作出SARS临床诊断。（3）确定诊断：在疑似和临床诊断的基础上，若分泌物或血清SARS-CoVRNA检测阳性，或血清（或血浆）SARS-CoV特异性N蛋白抗原检测阳性，或血清SARS-CoV抗体阳转，或抗体滴度4倍及以上增高，则可做出确定诊断。SARS的诊断标准呼吸道样本拭子或抽吸物鼻咽拭子气管、支气管深部灌洗，肺泡灌洗液样本转移液SARS实验室检测方法一览表常用检测方法检测所需时间检测结果的解释及意义病毒核蛋白（N）抗原ELISA检测４小时发病1-10天（3-5天敏感）的血清样品，阳性有诊断意义。此方法比较敏感，用于早期诊断，方法稳定，受样品质量影响小。病毒核酸实时PCR检测４小时发病期3-10天的咽、肛拭子及血清样品，多样品阳性有诊断意义。此方法用于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。病毒核酸常规PCR检测６小时同上，可用于核酸序列测定，核酸测序有诊断意义。此方法用于早期诊断，方法较稳定，比较敏感，但受样品质量影响大。IgG和IgM的ELISA和荧光检测４小时发病10天左右的血清才能检出，4倍升高或阳转有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，方法较稳定。中和抗体的检测3-5天发病10-22天血清能够检出，4倍升高有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，方法较稳定。病毒分离5-10天发病1-10天，咽肛拭子及血清样品，阳性有诊断意义。此方法用于中晚期诊断，爱样品影响大。SARS网络实验室检测内容与方法建议诊断时期内容方法标本

早期诊断血清Ｎ抗原ELISA,PCR血清，鼻咽拭子发病5天以内病毒核酸中期诊断病毒核酸PCR,ELISA

血清，鼻咽拭子发病10天以内血清Ｎ抗原IFA,NT

粪便，肛拭，尿

IgM,IgG&NAb

晚期诊断IgM,IgG&NAb

ELISA,

NT血清，鼻咽拭子发病10天以上病毒核酸

PCR,IFA粪便，肛拭，尿血清Ｎ抗原

建议对不明原因重症肺炎常规进行血清SARS-CoVN蛋白检测

HCoV（2012）

实验室检测近期曾往中东地区，出现上呼吸道感染后，如果症状加重，或呼吸困难，建议立刻就诊并进行实验室检测。WHO发布了临时病例定义来帮助各国加强针对这种新病毒的健康保护措施。基于目前发现的病例，分为“正在调查中的病人”、“可能病例”和“确诊病例”。病例的分类基于临床、流行病学和实验室检测指标。目前可进行分子检测（PCR与荧光定量PCR）London1_novel_CoV_2012_nsp12(partial)TATTAGTGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCACAATGACTAATCGCCAGTACCATCAGAAAATGCTTAAGTCCATGGCTGCAACTCGTGGAGCGACTTGCGTCATTGGTACTACAAAGTTCTATGGTGGCTGGGATTTCATGCTTAAAACATTGTACAAAGATGTTGATAATCCGCATCTTATGGGT(208nt)partialnucleotidesequenceoftheviralpolymerase(nsp12)系统发生分析HPA公布的结果，2012-9-25GenBankBLAST比对结果1.2.London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列与与SARS-CoV-Tor2株相应区段同源性为73.6%引物设计与应用起止位点引物对引物序列(5’-3’)片段大小（bp）备注7208F-1R-1TGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTTACCCATAAGATGCGGATTATCAACA20126134F-2R-2ACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGCTAGTACCAATGACGCAAGTCGCTCC10949荧光探针TZ1CTAATCGCCAGTACCATCAGTaqMan探针60荧光探针TZ2AGCACAATGACTAATCGCCATaqMan探针基于上述引物探针，我们已建立常规PCR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1;nestedPCR:F-1,R-2；PCR片段127bp)两种荧光定量PCR方法（F-1,R-2，TZ1；或F-2,R-2，TZ2)与其他人冠状病毒无交叉反应；可初步用于新型冠状病毒（2012）的实验室检测。引物设计与应用2引物对引物序列(5’-3’)片段大小（bp）备注HKU4-f1HKU4-r1GACTAATCGTCAATATCACCACCCATTAAATGTGGACTC150Bat-CoV-HKU4检测HKU4-f2ACACCAGAAGAAGAAGAAGAC135（HKU4-r1合用）Bat-CoV-HKU4检测HKU5-f1HKU5-r1GACTGTTGCCGCAGAAACGATCACCCATCAAGTGAGGATTA185Bat-CoV-HKU5检测HKU5-f1HKU5-r2GTGAGGATTATCAACATCCTTATAC170Bat-CoV-HKU5检测基于对London-1NovelCoronavirus已知序列与Bat-CoV-HKU多株序列比对，我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分别用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特异性检测。巢式PCR普通PCRPCR产物电泳或测序逆转录，获得cDNA核酸提取

荧光定量PCR

鼻咽拭子标本PCR检测实验方案核酸(基因)检测基因扩增(PCR)

靶序列模板DNA35个循环340亿拷贝标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒可以确定存在感染PCR产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验冠状病毒检测通用引物对:

Cor-FW(5'-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3')

Cor-RV(5'-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘)冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳One-stepRT-PCRassays(OneStepRT-PCRkit;QIAGEN)a50μlreactionvolumecontaining10μLRNA-extract,10μl5xQIAGENOneStepRT-PCRBuffer,2μldNTPmix(finalconcentrationof400μMofeachdNTP),1.8μlQIAGENOneStepRT-PCREnzymeMix(acombinationofOmniscriptandSensiscriptreversetranscriptaseandHot-StarTaqDNApolymerase),4μMofeachprimer,andRNase-freewaterto50μl.Thereactionwascarriedoutwithaninitialreversetranscriptionstepat50°Cfor30min,followedbyPCRactivationat95°Cfor15min,50cyclesofamplification(30secat94°C;30secat48°C;1mina