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文档简介

[键入文字]验证EMSA服务案例验证EMSA服务案例实验目的利用NF-κB对应的探针，对5例细胞核蛋白提取物进行验证EMSA检测。实验目的根据特异性的探针序列合成生物素标记的NF-κB探针，与核蛋白进行结合反应后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过电转将胶上的蛋白-DNA结合物及未结合的DNA转移到尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，用酶反应显色，从而检测DNA与蛋白有无结合条带。操作步骤1.合成生物素标记探针（客户提供序列）：NF-κB-F：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'NF-κB-R：5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'2.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：在15ml试管中，按顺序放入ddH2O7.15ml，30%聚丙烯酰胺溶液2ml，5×TBE1ml，甘油175ul，10%APS75ul，TEMED8ul；3.4℃，100V电压预电泳约60min；4.根据PIERCE公司EMSA试剂盒（货号：20148）要求配制结合反应液，室温放置15min；5.根据泳道要求，加入探针，室温放置35min；6.加入5ulLoadingBuffer到每一个结合反应中，混匀，上样；7.4℃，100V电压电泳，至溴酚兰电泳至2/3凝胶长度时停止电泳；8.转膜：将合适大小的尼龙膜浸泡在0.5×TBE中15min，按照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵按顺序放好，筛孔板固定，仔细去除夹心内所有气泡，凝胶面向阴极插入电泳槽中，倒入0.5×TBE，300mA恒流电转移30min；9.紫外线交联；10.化学发光法检测生物素标记的DNA：参照PIERCE公司LightShift®ChemiluminescentEMSAKit说明操作；11.50℃水浴温和地将封闭缓冲液（blockingbuffer）和4×漂洗缓冲液（WashBuffer）预热，直至颗粒物全部溶解；12.将膜放入洁净的塑料平皿中，加入20ml封闭缓冲液，放在摇床上温和摇动15min；13.吸取66.7ul辣根抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶底物到20ml封闭缓冲液，混匀备用；14.将封闭缓冲液倒去，加入步骤10所配溶液，放在摇床上温和摇动15min；15.取40ml4漂洗缓冲溶液到120mlddH2O中，得到1漂洗缓冲溶液；将膜转移到一个新的塑料平皿，加入20ml1漂洗缓冲溶液漂洗5min，共漂洗4次；16.将膜转移至另一新的塑料平皿，加入30ml底物平衡缓冲液，平衡5min；17.配置底物工作液（SubstrateWorkingSolution）：将6mlLuminol/EnhancerSolution加入到6mlStablePeroxideSolution中，混匀，避光保存备用；18.将膜从底物平衡缓冲液中拿出，正面朝上放到新的洁净平皿中，将底物工作液倒入膜的表面，避光放置5min；19.将膜从底物工作液中取出，用塑封膜封好，避免气泡和皱褶；20.机器曝光并记录结果。实验结果特异性抗体特

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