化诊见习 实验一：血液一般检测

实验一血液一般检测

【内容】1、掌握毛细血管采血法2、血涂片制备和染色3、外周血白细胞计数和分类4、改良牛鲍计数板的使用【原理】1、采血针刺破毛细血管后血液自然流出，用微量吸管吸取一定量的血液。2、挤压乳胶吸头使刻度微量吸管产生负压而吸取液体。3、把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用复合染料染色。细胞染色包括物理吸附及化学亲和作用。不同的细胞种类及细胞的不同成分，对酸性及碱性染料的结合能力不同，而使各种细胞呈现出各自的染色特点。【操作】一、毛细血管采血法1．准备2．按摩3．消毒4．针刺5．拭血6．采血7．稀释准备：取试管1支编号，加380μL生理盐水备用。取微量吸管与乳胶吸头相连。注：检查微量吸管与乳胶吸头连接处：避免漏气。按摩：轻轻按摩采血对象无名指指端内侧，使局部组织自然充血。注：采血部位要求：皮肤完整，无炎症、冻疮等皮损。婴幼儿可选拇指、足趾、足跟内外侧缘。消毒：用75％乙醇脱脂棉球擦拭采血部位皮肤，待干。注：

1.创伤性实验：须严格无菌操作。

2.消毒待干后采血：否则细胞破坏。针刺：用左手拇指和示指固定采血部位，使皮肤和皮下组织绷紧，右手持采血针自指端腹内侧迅速刺入2～3mm后，立即出针。注：

1.绷紧采血部位：利于进针、减轻疼痛感。

2.进针要求：动作要迅速，伤口深度要足够，尽量使血液自然流出。针刺用力轻重视指端皮肤厚薄而异。拭血：待血液自然流出后，用无菌干棉球擦去第1滴血。注：第1滴血：混有组织液，应拭去采血：血液自然流出时，用微量吸管吸血至20µL刻度，然后用无菌干棉球压住伤口止血。如血流不畅，可用左手自采血部位远端向指端稍施压，使血液流出。注：

1.吸血：速度不宜过快和中断，避免吸管内出现气泡和间断。

2.避免挤压：防止组织液混入、血液凝固，血小板计数可明显减少。稀释：用无菌干棉球擦净微量吸管外壁，将吸管伸入置有生理盐水试管底部，慢慢排出吸管内血液，并用上清液冲洗管内余血2～3次，最后将试管内的液体混匀。注：

1.血量调节：若微量吸管内血液超出刻度线，可用无菌干棉球小心吸取调至刻度。

2.避免溶血：排出血液和混匀试管内液体时动作应轻柔。

二、血涂片的制备和染色（示教）1、制片标记载玻片→取血→推片→干燥标记载玻片：在载玻片一端做标记（视标记端为头端，另一端为尾端）。注：载玻片：应清洁、干燥、中性、无油污。取血：用微量吸管在距载玻片头端大约1㎝处加抗凝血1滴。注：

1.抗凝血标本：取血前应充分混匀。

2.滴加血滴：避免出现气泡。

推片：左手平执载玻片头、尾两端，右手持推片一端，与载玻片头端成一锐角（＜90°），从载玻片尾端向头端滑动接触血滴，待血滴沿推片边缘展开到适当宽度时，推片立即与载玻片头端呈30°～45°角，轻压边缘，匀速流畅地向载玻片尾端推动，形成厚薄适宜的血涂片。注：

1.血片厚度：血滴大、推片与载玻片角度大、推片速度快、血膜则厚；反之则薄。血粘度高，血膜宜薄；反之宜厚。

2.良好血涂片：血膜头、体、尾分明；头尾（距尾端1～2㎝为宜）及两侧有空隙。良好的血涂片为血膜由厚到薄逐渐过度，在血膜体尾交界部位，红细胞分布均匀，既不重叠又互相紧靠相连。

3．推片：边缘应光滑平整；推片时勿改变角度和速度。干燥：在空气中挥动血涂片，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，可置于37℃温箱中促干或在酒精灯远离火焰的上方火焰挥动烘干。注：酒精灯烘干：切忌靠近火焰处高温烘烤，以免细胞形态改变。2、染色：将标记好的血涂片平置于染色架上，滴加瑞氏染液数滴，以覆盖整个血膜为宜，等待0.5～1min后，滴加1.5-2倍缓冲液，用吸耳球吹匀，使染液充分混合。室温放置5～10min左右，流水冲洗，晾干。

注：

1．血涂片：未干时勿染色，否则，染色时细胞易脱落。

2．染液pH：新鲜配制染液偏碱，染色效果较差；染液置于时间越久，染色效果越好。

3．加染液量：应适量，过少易蒸发沉淀于血涂片上，不易冲洗，影响细胞形态的观察和鉴别。

4．染色时间：与细胞数量成正比；与染液浓度、染色时室温成反比。冲洗：用流水冲去染液，待干。注：

1．冲洗方法：应流水冲洗但不能先倒去染液，防染料沉淀于血涂片上。

2．冲洗时间：不能过久，以防脱色。

3．晾干方法：冲血涂片洗完，应直立于支架上待干。观察：置血涂片于显微镜下观察细胞呈色特征：成熟红细胞粉红色，白细胞核紫色，不同细胞胞质颗粒呈特异色泽，血小板紫色。【内容】1、掌握毛细血管采血法2、血涂片制备和染色3、外周血白细胞计数和分类4、改良牛鲍计数板的使用【原理】1、用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞和血小板。将稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。【器材】显微镜、改良牛鲍计数板、白细胞稀释液、微量吸管、瑞氏染液及缓冲液、载玻片、盖玻片等

【试剂】白细胞稀释液：2％冰醋酸溶液中加入10g／L结晶紫(或亚甲蓝)3滴。【标本】外周血：毛细血管血或EDTA抗凝静脉血【操作步骤】1．加稀释液380μl2．吸取血液新鲜全血或末梢血20μl3．混匀4．充池室温静置2～3min。5．计数在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数N。6．计算白细胞/L=N/4*10*20*10^6=N/20×109/L加稀释液：取试管１支，加白细胞稀释液380μL。注：稀释液：须新鲜、过滤无杂质和颗粒。采血及加血：用微量吸管采集毛细血管血或吸取抗凝血20μL，擦尽吸管外余血。轻轻加至白细胞稀释液底部，再小心吸取上清液清洗吸管2～3次，立即混匀。注：

1．采血操作：不能过度挤压，针刺深度须达2～3mm。

2．计数时限：血液稀释后应在30min内计数完毕，避免稀释液挥发。充池：待试管中细胞悬液完全变成棕褐色后，再次混匀，用微量吸管（或加样枪）吸取细胞悬液一滴，滴于盖玻片下方边缘处，使悬液充入计数池内，室温下静置2～3min，使细胞下沉。注：

1．充池前：应充分混匀，但应避免剧烈振荡。

2．充池中：应一次完成，避免断续冲液、满溢、充液不足或产生气泡；否则应重新充池。

3．充池后：不能移动或触碰盖玻片。计数：在低倍镜下依次计数四角4个大方格内的白细胞数。注：计数池中白细胞分布：应均匀，否则应重新充池计数。计算白细胞/L=N/4×10×20×106=N/20×109/L参考值：成人:(3.5～9.5)×109／L血细胞形态学检验

血细胞低倍镜观察：低倍镜下浏览全片，了解细胞染色和分布情况。注：白细胞应选择细胞分布均匀、染色效果好的区域，常在体尾交界处或涂片3/4区域进行分类。油镜观察：加香柏油1滴，在油镜下观察各类细胞形态：细胞大小、形态、数量；核质比；核大小、形态、染色质结构和染色情况、核膜、核仁数量；胞质量、色泽、颗粒数量和着色等。体尾交界处分类计数100个白细胞，并且观察红细胞及血小板形态。清洁显微镜：显微镜用毕后，先清洁镜头，再将镜头转成“八”字形，加镜罩，置放原位。

【参考值】白细胞分类百分率（%）中性杆状核粒细胞1～5中性分叶核粒细胞50～70嗜酸性粒细胞0.5～5嗜碱性粒细胞0～1淋巴细胞20～40单核细胞3～81.中性杆状核粒细胞，大小与分叶核粒细胞相似，圆形。胞核凹陷程度超过该核假设直径的一半，核径最窄处大于最宽处1/3以上，形态弯曲成带状，核染色质粗糙呈块状，染深紫红色，也可见核呈S形、U形、E形。胞质充满中性颗粒。

2.中性分叶核粒细胞：胞体圆形，胞核分叶状，叶与叶之间有细丝相连，核常分2-5叶，核染色质浓集或呈较多小块，染深紫红色。胞质丰富，染淡红色，胞浆内分布着细小紫红色中性颗粒。3.嗜酸性粒细胞：胞体圆形，胞核多分两叶，胞质充满粗大的橘红色嗜酸性颗粒。4.嗜碱性粒细胞：胞核不清，胞质内及胞核上含有紫黑色、大小不均的嗜碱性颗粒。5.淋巴细胞：大淋巴细胞：胞体圆形，胞核椭圆形稍偏一侧，核染色质排列紧密而均匀。胞