苯酚法提取演示文稿

苯酚法提取演示文稿当前第1页\共有22页\编于星期三\11点苯酚法提取当前第2页\共有22页\编于星期三\11点基本原理

细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。当前第3页\共有22页\编于星期三\11点

本实验采用的0.15mol/L缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离，而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离；用酚处理时DNA-蛋白复合物变性，在低温条件下从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的DNA极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA制品，可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA不仅纯度高，而且多呈自然状态，可供继续研究之用。基本原理当前第4页\共有22页\编于星期三\11点主要试剂：

（1）SDS-缓冲液：0.3％SDS，0.1mol/LNaCl，0.05mol/L乙酸钠，用乙酸调到pH5.0。

SDSNaCl乙酸钠当前第5页\共有22页\编于星期三\11点主要试剂（2）饱和酚液：重蒸苯酚用SDS溶液饱和。当前第6页\共有22页\编于星期三\11点主要试剂（3）氯仿-异戊醇液：24﹕1（V/V）。氯仿异戊醇液当前第7页\共有22页\编于星期三\11点主要试剂：（4）含2％乙酸钾的95％乙醇溶液。当前第8页\共有22页\编于星期三\11点主要试剂：（5）无水乙醇（6）溶菌酶（B.R.（1mg/L）当前第9页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器：（1）台式高速离心机（10000r/min）当前第10页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器：（2）Eppendorf管（50mL）当前第11页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器：紫外可见分光光度计当前第12页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器分析天平当前第13页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器真空干燥器当前第14页\共有22页\编于星期三\11点主要仪器电子天平当前第15页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：1．粗提取RNA称量干燥的Eppendorf管的质量,取活性干酵母在研钵中研碎，取1g加入Eppendorf管,加10mLSDS-缓冲液使成匀浆。再加溶菌酶1mL，混匀，室温静置10min，再加10ml饱和酚液，室温下剧烈振荡5min，置冰浴中分层。当前第16页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：2．分离RNA

在0～4℃低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf管。3．提纯RNA

加同上清液等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管。当前第17页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：4．沉淀RNA

加2倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，当前第18页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：5．洗涤RNA

沉淀用少许无水乙醇洗一次，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。当前第19页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：6．RNA制品纯度的测定及RNA提取率的计算

将干燥后RNA产品配制成浓度为10—50μg／ml的溶液，在紫外可见分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA制品纯度及RNA提取率当前第20页\共有22页\编于星期三\11点实验步骤：RNA含量=

RNA提取率=100%

式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lμgRNA的吸光度当前第21页\共有22页\编于星期三\11点注意