肿瘤抗血管生成疗法课件

詞彙介紹血管生成(Angiogenesis)癌細胞轉移(Metastasis)內皮細胞(Endothelialcell)促血管生成以及抑制血管生成之因子(Anti-andpro-angiogenicfactor)Angeion:vesselgenesis:formationNormalangiogenesis正常胚胎血管新生

(NormalAngiogenesisinEmbryo)胚胎發育過程中，需要大量的養分以及代謝，新生之血管生成才足以供應快速發育之胚胎正常之生長所需。正常成體血管新生(NormalAngiogenesisinAdults)因為新生之組織需要大量的營養成分以及修補物質，而免疫系統的成員亦在此過程中扮演重要角色，而為新生之血管所運送至受傷的組織內。HistoryofAntiangiogenicDrugs1971:Thefieldbeganinearly1970swithJudahFolkman’shypothesisthattumorgrowthwouldbehaltedifitweredeprivedofabloodsupply1989:Dr.NapoleneFerraidentifiedandisolateVEGF1996:Dr.JefferyIsnerpublishedfirstclinicaltrialsregardingVEGF2004:FDAapprovesfirstantiangiogenicdrugtotreatcolorectalcancer(Avastin)Robusttumorgrowthrequiresthepresenceofalocalvascularnetworkthatsuppliesbothoxygenandnutrientstotumorcells.Angiogenesis…anti-angiogenicfactorsTheAngiogenicBalancepro-angiogenicfactorscontents一、血管生成与肿瘤（1）血管生成的一般过程（2）肿瘤血管生成（3）肿瘤血管生成与肿瘤的发生、生长和转移二、肿瘤血管生成的评估三、血管生成抑制剂研究及临床应用现状四、抗血管生成治疗与提高放射治疗敏感性五、抗血管生成药物临床试验存在的一些问题

第一节、血管生成与肿瘤

（1）血管生成的一般过程血管生成(angiogenesis)是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血缺氧和炎症等情况下，原有微血管内皮细胞(endothelialcell，EC)经过生芽、迁移、增殖与基质重塑等形成新毛细血管的过程。StructureofvesselsandcapillariesMonocellularlayerofendothelialcellsSmallartery:Capillary:

endothelialcell,basallamina,pericytesAngiogenesis:Sproutingofcellsfrommatureendothelialcellsofthevesselwall(secretionofproteases,resolutionofBasallamina,migrationtowardsChemotacticgradient,proliferation,Tubeformation)VEGFisfactorlargelyspecificforendothelialcells,bFGFcanalsoinduce,notspecificforEC)capillariessproutingin

theretinaofanembryonicmousecapillarylumenopeningupbehind

thetipcell(reddyeinjected)包括五个阶段：①receptionofangiogenicsignals(yellowspot)fromthesurroundingbyendothelialcells(EC);②血管细胞分泌蛋白水解酶降解血管基底膜；③EC穿过基底膜迁移到血管周围基质；④EC增殖、相互黏附并连接；形成管腔样结构；⑤基质重塑和平滑肌细胞的包绕及血管的相互吻合形成血管网调节血管生成的因素A调节血管生成的因子及其作用B血管壁基质在血管生成中的作用

C蛋白水解酶系统对于血管生成的调节

A调节血管生成的因子及其作用

血管生成促进因子成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactors，FGFs)、血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactors，VEGFs)、血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)、转化生长因子-α(transforminggrowthfactor-α，TGF-α)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、IL-6、胎盘生长因子等，其中以VEGF作用最强而血管生成抑制因子血管生成抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、IL-12、IL-10、血小板因子-4(PF4)、凝血酶敏感蛋白(thrombospondins,TSPs)、IFN-α、IFN-β和angiopoietin-2等，其中以血管抑素的作用最为突出Sproutingtowardschemotacticgradient:VEGF尖端细胞（Tipcells)、柄细胞（Stalkcells)、束细胞（Phalanxcells)B血管壁基质在血管生成中的作用

细胞外基质(extracelluarmatrix，ECM)是血管壁及血管周围组织的重要结构成分，主要包括胶原、非胶原支持分子和蛋白多糖/氨基多糖等成分在血管生成的诱导期，基底膜发生降解，结构成分出现变化，这有利于EC的迁移、增殖与管样结构的形成。而在血管生成的后期，基底膜发生重塑，形成围绕新生血管的支持结构C蛋白水解酶系统对于血管生成的调节调节血管生成主要的两大蛋白水解酶系统纤溶酶原激活物(PA)及其抑制物(PAI)系统组织型纤溶酶原激活物(t-PA)：EC所合成、贮存和释放尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)：肾小管上皮细胞和血管EC等合成基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制物系统MMPs则是一组可以降解大多数ECM成分的蛋白水解酶（2）肿瘤与血管生成肿瘤血管形成因子(tumourangiogenesisfactors，TAF)①TAF仅来源于肿瘤细胞，无种属特异性；②TAF多存在于细胞浆中(但不存在于线粒体或微粒体中)，有的也游离于胞核，尤其是核内非组蛋白的部分；③TAF导致血管形成的机理是促进宿主毛细血管内皮细胞的分裂(mitogeniceffect)和刺激毛细血管生长Mechanismsoftumorneovascularization.(A)Endothelialsproutingisthedominantprocessofvesselgrowth.Luminalendothelialcellsmigratethroughthevesselbasementmembraneintotheunderlyingextracellularmatrix,developinganelongated'sprouting'morphology.(B)Vasculogenicmimicryisthedevelopmentofmicrovascularchannelsbyaggressivetumorcells.(C)Vesselco-optioninvolvestheuseofthepre-existingvasculatureinthehosttissue.(D)Theprocessoftumorneovascularization,involvingthereleaseofproangiogenicfactors(e.g.VEGF)bytumorcellstocauseendothelialactivation,bloodvesselgrowth,andsubsequenttumorexpansion.Mechanismsoftumorneovascularization出芽血管拟态血管共生肿瘤新生血管形成的过程(1)肿瘤细胞及其它相关细胞如血管内皮细胞释放多种血管生成因子。(2)在血管生成因子的作用下，血管内皮细胞发生形态改变，包括细胞器数目的增多、大小的改变以及伪足的形成。(3)内皮细胞和肿瘤细胞释放多种蛋白溶酶以降解细胞外基质和毛细血管基底膜，继而引起细胞外基质重塑。(4)内皮细胞从毛细血管后微静脉迁移出来，形成血管新芽。(5)血管内皮细胞增殖。(6)肿瘤血管结构重建。肿瘤4.肿瘤新生血管形成1.分泌血管形成因子3.内皮细胞增生迁移2.对细胞外基质产生蛋白降解作用毛细血管出芽肿瘤新生血管的形态结构和功能特点MosaicvesselsFigure13.33TheBiologyofCancer(©GarlandScience2007)TumorvesselisonlypartiallyoverlaidbypericytesandSMC肿瘤内微血管的形态结构表现出很大的差异，不规则的狭窄、扩张及扭曲，仅排列一层内皮细胞、基底膜缺乏或变薄引起肿瘤微血管通透性增高以及易于遭受癌细胞入侵的组织学基础。肿瘤微循环表现出低效和相对不足肿瘤细胞的更新速度超过内皮细胞2倍，组织间隙流体静压高，血流阻力加大（3）肿瘤血管生成与肿瘤的发生、生长和转移无血管期：在肿瘤生长的早期并没有肿瘤血管出现，肿瘤只向周围生长，而且生长较慢，“细胞群体休止状态”，但非“个体休止状态”早期血管期：当肿瘤血管生成发生后,得到充足的营养供给，肿瘤生长迅速；晚期血管期：肿瘤逐渐增大，肿瘤中央血管出现坏死，肿瘤周围血管增多侵袭和转移1589breastcancerpatientswerefollowedforperiodsaslongas46yearsafterinitialdiagnosisandtreatment第二节、肿瘤血管生成的评估微血管定量已成为研究的焦点之一，血管生长因子的检测：VEGF微血管密度(microvesseldensity，MVD)VEGF的检测方法免疫组化法ELISA法Westernblot法RT-PCR法IHCimageofVEGFstaininginhumanlivercarcinomaformalinfixedparaffinembeddedtissuesection(microvesseldensity，MVD)采用免疫组化技术，选择某些特异性抗体，如：Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RA)、CD31、CD34、UEA-1等标记肿瘤组织血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，即为MVD的检测Vesselandmicrovesseldistributionsofthetransfectedmelanomatumors.Toevaluatetheendothelialcellcontentoftumors,thefixed,embeddedtumortissuesweresectionedandstainedforimmunoreactiveCD31incontroltumors(A)and(B)andIP-10-transfectedmelanomatumors(C)and(D).(E)MicrovesseldensitywasdigitallymeasuredfromfiverandomfieldsusingtheImage-ProPlusprogram(MediaCybernetics,LP).MolecularTherapy(2004)9,846–855MicrovesseldensityisreducedinthyroidtumorscontainingPPFP.ImmunohistochemicalanalysisofFA(A,B)andFTC(C,D)demonstrateda2.3-and2.5-folddecrease(P<0.005andP<0.05,respectively)inmicrovesseldensityasmeasuredbyCD31staininginadenomasandcarcinomascontainingPPFP,respectively(B).ReddiHetal.Genes&Cancer2010;1:480-492follicularadenomas(FA)andcarcinomas(FTC)

第三节、血管生成抑制剂研究及临床应用现状

肿瘤血管生成抑制剂(tumorangiogenesisinhibitor，TAI)是一类能破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤的生长和转移的药物。优势：①治疗发生时，血管形成已被启动，故TAI治疗具有良好的特异性；②血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，故剂量小、疗效高、副作用小；③内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。抑制肿瘤血管生成的策略(1)利用小分子药物和内源性血管生成抑制因子直接抑制血管内皮细胞增殖、迁移,抑制细胞外基质形成,诱导血管内皮细胞凋亡;(2)利用中和抗体、可溶性受体、受体拮抗剂阻断血管生成因子传递;(3)利用反义核酸或生物因子抑制血管生成促进因子表达。TAI可分为五大类：①抑制基底膜降解，②直接抑制内皮细胞增殖:Endostatin等；③抑制血管生长因子活化:VEGF单抗、VEGF-毒素偶合物、VEGFR单抗等；④抑制内皮细胞特异性整合素/生存信号；⑤非特异性TAI:如Suramin、钙通道阻断剂碳氧氨咪唑(carboxyaminoimidazole，CAI)、IL-12和IFNα-2ａ等。(1)直接抑制内皮细胞增殖沙利度胺TNP-470(AGM-1470)血管抑素(angiostatin)内皮抑素(endostatin)血管生成抑制素(Canstatin)重组血小板因子-4(rhPF-4)CM101环氧化酶-2(cyclooxygenase2,COX-2)ZD6126内皮抑素EndostatinDiscoveredin1995byJudahFolkmanetalPhaseIclinicaltrialin1999Dr.JamesWatsonpredictedthatDr.Folkmanwouldcureallcancerwithin2yearsDr.Folkman’sresponse“Ifyouareamouseandhavecancerwecantakegoodcareofyou.However,inourexperimentswemostlysacrificethemice.So,Idon'tknowifthatqualifiesastakinggoodcare”EndostatinmonomerEndostatin

的发现O’reillyMS,etal.Cell1997;88:277-285.O’reillyMS,etal.Cell1997;88:277-285.Endostatin的抑瘤试验第一步：直径大于1～2mm3的肿瘤释放VEGF及招募bFGF因子启动肿瘤血管生成步骤。

第二步：VEGF及bFGF刺激毛细血管内皮细胞增殖及内皮细胞迁移肿瘤，形成血管供给肿瘤所需营养物质。

第三步：血管内皮抑制素靶向毛细管内皮细胞，抑制正在形成的肿瘤血管。

第四步：在内皮细胞表面可以识别血管内皮抑制素的特异性受体诱导毛细内皮细胞死亡。第五步：携带营养的新形成的血管被破坏。

第六步：由于缺少营养供给，肿瘤细胞死亡。

Folkman教授的理论及血管内皮抑制素（Endostatin）的作用机理内皮抑素的作用机理1、下调血管内皮生长因子VEGF的表达。KimYM,etal.JBC,2002,277(31):27872-27879.2、抑制金属蛋白酶MMP-2的活性。LeeSJ,etal.FEBSletters,2002:147-152.3、抑制内皮细胞迁移，引起细胞周期停滞，诱导内皮细胞凋亡。MacDonaldNJ,etal.JBC,2001,276(27):25190-25196.HanaiJI,etal.JCB,2002,158(3):529-539.4、

降低体内血管生成促进因子的表达，提高体内血管生成抑制因子的表达，通过影响人体基因组近12%的基因来抑制体内的病理性血管生成。FolkmanJ.ExperimentalCellResearch,2005.我国首家开发endostatin药物

山东麦得津生物工程股份有限公司

通用名：重组人血管内皮抑制素注射液注册商标：恩度TMEndostarTM

英文名：RecombinantHumanEndostatin Injection类别：生物制品一类规格：15mg/3ml/支(2.4×105u/支)代号：YH-16恩度TM(Endostar)首先，恩度TM不是单纯的

Endostatin，是在

ES母体上创造性的添加了9个氨基酸的新型

Endostatin，不仅使

ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加。先进的工艺，恩度TM是纯度大于99.9%高纯生物制剂。恩度TM是人源化蛋白，不会诱导自身抗体产生。恩度TM的蛋白非常稳定，可以室温放置一年仍然保持活性，而国外的同类产品需要

-80℃冷冻保存。Ⅲ期临床试验表1.两组患者的疗效比较主要指标NP＋YH-16NP+安慰剂P值总有效率(%)35.419.50.0003初治40.023.90.003复治23.98.50.03总临床受益率(%)73.364.00.035初治76.565.00.02复治65.261.70.68总中位TTP(月)6.33.60.0000初治6.63.70.0000复治5.73.20.0002总中位生存时间（月）14.879.900.0000初治15.169.770.0000复治14.6710.000.01861年生存率（％）62.7531.460.0000初治64.0831.830.0000复治59.4529.870.0186NP（长春瑞滨联合顺铂）Ⅲ期临床试验图1.两组患者生存Kaplan-Meier曲线

试验组中位生存期延长了5个月（14.9月VS9.9月,延长5.0月，P<0.0001

），1年生存率提高31.29%(P<0.0001)。Ⅲ期临床试验表2.两组患者的不良反应比较(n=493)毒性类型NP＋YH-16（n=322）NP＋安慰剂（n=167）总不良反应3/4度总不良反应3/4度病例数％病例数％病例数％病例数％中性粒细胞减少17152.49328.58550.94728.2出血10532.2113.44728.153.0贫血5115.672.12515.031.8血小板减少20.60010.600恶心/呕吐16550.6268.09053.9116.6腹泻123.710.384.821.2便秘5516.910.33621.621.2粘膜炎30.910.30000转胺酶226.820.684.800总胆红素61.810.310.600发热61.80010.600皮疹20.610.321.210.6疲乏10431.9123.76136.531.8疼痛3811.720.61810.842.4过敏30.910.30000周围神经毒性30.90053.010.6脱发3912.0002313.821.2心律失常216.410.363.600注：两组不良反应发生率比较无明显差异

2006年的第一版非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）已将恩度联合化疗列入了一线标准化治疗方案(2)阻断血管生成因子活性的药物

VEGF及其受体抗VEGF抗体抗VEGFR抗体可溶性VEGF受体VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂短肽抑制剂FDAapproveddrugsGefitinib(Iressa®)

MechanismofActionSelectivelyinhibitsEGFR-TKBlockageofdownstreamEGFRsignaltransductionpathways,cellcyclearrest,andinhibitionofangiogenesisAvastin(bevacizumab)AvastinisahumanisedmonoclonalantibodythatspecificallyinhibitsVEGFAvastinrecognisesallmajorisoformsofhumanVEGF1.Presta,etal.CancerRes1997AvastincausesregressionoftumourvasculatureInapreclinicalmodelusinghumantumour(coloncancer)xenografts,asingleinfusionofAvastindecreasedtumourvascularvolumeby80%1within24hoursofinfusionAvastinsignificantlyreducedMVDinpatientswithrectalcancerinaclinicalsetting2Yuan,etal.PNASUSA1996Willett,etal.NatMed2004ControlAvastinMVD=microvesseldensityAvastinnormalisesexistingtumourvasculatureInpreclinicalmodels,Avastinhasbeenshowntopruneimmaturevasculaturereducevesselpermeabilityreduceintratumouralpressure1theseeffectsmayhelpmaketumourcellsmoresensitivetocytotoxicchemotherapy2–4JainRK.NatMed2001;7(9):987–9,1.Gerber,Ferrara.CancerRes2005

2.Jain.NatMed2001;3.Jain.Science2005

4.Kerbel.Science2006c)‘Normalised’tumour

vasculatureb)Abnormalvasculaturea)NormalvasculatureSummary:AvastinmodeofactionAngiogenesisisfundamentalfortumourgrowth,andVEGFisthepro-angiogenicfactoratthecentreoftheangiogenicpathwaycontinuousexpressionofVEGFbythetumourmakesitarationaltargetforcancertherapyDirectinhibitionofVEGFbyAvastinallowsforgreaterprecisionthanothermeansoftargetingtheVEGFpathwayunwantedinhibitoryeffectsonnon-VEGF-mediatedfunctionsareavoidedAvastinhasthreesuggestedeffectsontheangiogenicprocess:regressionoftumourvasculaturenormalisationofsurvivingtumourvasculatureinhibitionofnewandrecurrentvesselgrowthRegressionInhibition(keyinadjuvantsetting)NormalisationExpensiveNewDrugs:

AreTheyWorthIt?2007salesof$2.3billioninUS($3.5billionworldwide)totreatabout100,000patientswithadvancedlung,colonorbreastcancerGenentechprice:$4,000-$9,000amonthCosttoprivateinsurers:Ashighas$35,000amonthNYTimes,July6,2008What’sthebenefit?PhaseIIItrialofbevacizumabinmetastaticcoloncancerMedian

survival:15.6vs20.3mo(HR=0.66,P<0.001)Errorbarsrepresent95%confidenceintervalsHurwitzH,etal.NEngJMed.2004;350:2335-2342PercentsurvivingDurationofsurvival(mo)2001218300801004060TreatmentGroupIFL+placebo(n=411)IFL+Avastin(n=402)246Mediansurvivalbenefit:4.7monthsor30%increaseExaminingthecostandcost-effectivenessofaddingbevacizumab(Avastin)tochemoinmetastaticcoloncancerRandomizedtrialcomparedchemotherapyalonevs.chemotherapy+bevacizumabBevacizumabregimenprolongedmediansurvivalfrom15.6to20.3months(p<0.001)Costofextra4.7months?$101,500(assuming$5,000permonthforbevacizumab)$259,149peryearoflifegained(notqualityadjusted)第五节、抗血管生成治疗与提高放射治疗敏感性（1）血管生成与放射治疗

（2）抗血管生成治疗提高放射治疗敏感性

RADIOTHERAPYANDTUMORVOLUME

EXPECTEDEFFECTINTUMORCELLSDNAdamage;p53-mediatedapoptosis;mitoticcelldeath;senescence-likeirreversiblegrowtharrest;apoptosis

UNEXPECTEDEFFECTSINTUMORCELLSTumorgrowingwithinapreviouslyirradiatedbedtendstobemoreinvasiveandtoformmoremetastasis–TUMORBEDEFFECT(MilasLetal.IntJRadiatOncolBiolPhys1997;13:379-83)(MilasLetal.CancerRes1988;48:2116-20)

(ViciniFAetal.Cancer2003;97:910-9)(SuitHDetal.IntJRadiatOncolBiolPhys1992;23:653-60)(O’BrienCJetal.AmJSurg1986;152:456-63)(VikramB.etal.HeadNeckSurg1984;6:730-3)Clinically:Tumorrecidiveswithinapreirradiatedfieldareassociatedwithhigherriskofmetastasisandpoorprognosis（1）血管生成与放射治疗乏氧的肿瘤细胞,对射线的耐受能力增强：乏氧的细胞经照射后活性氧产生减少,由于射线对肿瘤细胞DNA的损伤作用主要依赖活性氧自由基,因此乏氧的肿瘤往往对射线不敏感。放射治疗不仅对肿瘤细胞有直接或间接杀伤作用，还具有封闭肿瘤